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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/24703
TOLERÂNCIA BACTERIANA AO MERCÚRIO RELACIONADA COM A ATIVIDADE DA ENZIMA MERCÚRIO REDUTASE
Bezerra, Adriana de Lima Almeida | Date Issued:
2012
Alternative title
Tolerance bacterial mercury-related activity of the enzyme mercuric reductaseAdvisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Estudos de tolerância ao mercúrio com Pseudomonas e exemplares da família Enterobacteriaceae sugerem que existe alguma ligação genética entre a resistência ao mercúrio e a resistência a alguns antibióticos, como ampicilina e estreptomicina. Pesquisas realizadas com bactérias resistentes ao mercúrio sugerem que a pressão seletiva ambiental e a transferência horizontal de genes, comum entre as bactérias, desempenharam um papel
fundamental na distribuição da resistência ao mercúrio. A redução enzimática de mercúrio e de organomercuriais é o mecanismo de resistência mais bem estudado, ocorrendo em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, de origem ambiental ou clínica. Este mecanismo de resistência envolve o operon mer que codifica uma séria de proteínas,
especialmente a enzima mercúrio redutase (MerA; EC 1.16.1.1), responsável pela redução catalítica do mercúrio. Bactérias com este gene estão envolvidas nos ciclos biogeoquímicos do mercúrio e podem ser usadas na sua biorremediação. Neste trabalho isolamos bactérias
tolerantes ao mercúrio do meio ambiente das cinco regiões brasileiras na busca de um exemplar com potencial para uso em biorremediação. Para este uso é preciso ter como critérios de seleção que a bactéria tenha o gene merA e expresse a enzima MerA em quantidades apreciáveis. Neste trabalho foi possível isolar bactérias tolerantes a 5μM de mercúrio de todas as regiões do Brasil. Dentre as bactérias isoladas, foram selecionadas as
amostras Gram-negativas com maior nível de tolerância ao Hg(II) e que demonstraram sensibilidade aos antibióticos mais comuns. Seguindo estes critérios, foi selecionada uma única amostra, identificada como Leclercia adecarboxilata M23, para investigar a relação entre a resistência ao mercúrio e os níveis de MerA. Os resultados mostraram que a
determinação quantitativa desta enzima é um processo trabalhoso que ainda não está totalmente consolidado. Apesar do processo de lise celular não ter sido o mais adequado, os extratos celulares obtidos por agitação com pérolas de vidro permitiram demonstrar a presença de MerA nos extratos de L. adecarxilata M23 e de Escherichia coli ATCC
35218, amostras genotipadas por PCR como positivas para merA. Em contraste, no extrato da amostra de E.coli ATCC 23724, que não apresentou banda correspondente ao gene merA, não foi possível detectar qualquer atividade de MerA. A determinação de MerA pelo decaimento dos níveis de NADPH, medido através da absorção de luz a 340nm, gera
problemas analíticos de difícil solução, já que o mercúrio reage com o NADPH mudando a sua absortividade neste comprimento de onda. Estas reações acontecem nos primeiros minutos de reação, implicando na necessidade de esperar algum tempo antes de considerar
o decaimento da absorção de luz como uma medida quantitativa da atividade da enzima. Estes problemas podem ser contornados com a determinação da enzima pelo consumo de mercúrio iônico ou pela volatilização deste metal, até mesmo por células intactas, como
pode ser demonstrado por avaliação de resultados da literatura. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a determinação quantitativa da atividade de MerA em extratos bacterianos não é um bom critério de seleção de bactérias para biorremediação. O comportamento de células em fase exponencial de crescimento expostas a concentrações
crescentes de mercúrio, metodologia denominada neste trabalho como ―desafio com mercúrio‖, foi capaz de demonstrar que as amostras bacterianas MerA+ apresentam um comportamento diferente da amostra MerA-. O comportamento ideal de uma bactéria seria aquele capaz de tolerar a adição do mercúrio na fase exponencial de crescimento celular
sem alteração da velocidade específica de crescimento, fato possível de ser encontrado na literatura, e que identificaria a amostra bacteriana com maior potencial para uso em biorremediação.
Abstract
Studies of tolerance to mercury with Pseudomonas and specimens of the family Enterobacteriaceae suggest that there is some genetic link between mercury resistance and resistance to some antibiotics such as ampicillin and streptomycin. Research conducted with bacteria resistant to mercury suggests that selective pressure on the environment and
horizontal gene transfer, common among bacteria, have played a key role in the spread of mercury resistance in bacterial communities. The enzymatic reduction of mercury is the best studied resistance mechanism, occurring in Gram-negative and Gram-positive bacteria, of clinical or environmental origin. This mechanism of resistance involves the mer operon that encodes a series of proteins, especially the enzyme mercury reductase
(MerA, EC 1.16.1.1), responsible for the catalytic reduction of mercury. Bacteria with this gene are involved in Hg biogeochemical cycle and can be used for its bioremediation. In this work, mercury tolerant bacteria were isolated from the environment of the five Brazilian regions, in the search of a specimen with potential for bioremediation use. To be used in this process the bacteria must have the gene merA and must express the enzyme
MerA in appreciable levels. It was possible to isolate bacteria tolerant to 5μM of mercury from all regions of Brazil. Among isolated bacteria, it was selected Gram-negative samples with higher tolerance to Hg(II) and sensibility to most common antibiotics. Following these criteria, it was selected a single sample, identified as Leclercia adecarboxilata M23,
to investigate the relationship between resistance levels of mercury and MerA activity. The results showed that quantitative determination of this enzyme is a laborious process that is not yet fully consolidated. Even though the process of cell lyses was not the most appropriate, the cell extracts obtained by shaking cells with glass beads allowed to
demonstrate the presence of MerA in the extracts of L.adecarxilata M23 and Escherichia coli ATCC 35218, which were genotyped by PCR as positive for merA. In contrast, in the extract of E. coli ATCC 23724, which showed no band corresponding to merA gene, it was not possible to detect any activity of MerA. MerA determination by NADPH decay, measured by light absorption at 340nm, has analytical problems difficult to solve, since
mercury reacts with NADPH changing its absorptivity at this wavelength. These reactions occur in the first minutes of reaction, implying the need to wait some time before considering the decay of light absorption as a quantitative measure of enzyme activity. These problems can be avoided assaying enzyme by ionic mercury decay or by mercury
volatilization, even using intact cells, as can be demonstrated by the data in the literature. The results of this work indicate that quantitative determination of MerA activity in bacterial extracts is not a good criterion for bacteria selection for bioremediation. The behavior of cells in exponential growth phase exposed to increasing concentrations of
mercury, methodology called "challenge with mercury", was able to demonstrate that bacterial samples MerA+ have a behavior difference. The ideal behavior would be a bacterium able to tolerate the addition of mercury in the exponential phase of cell growth without changing the specific growth rate, which has been described in the literature, identifying the bacterial sample with the greatest potential for use in bioremediation.
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