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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/36053
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2500-12-31
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PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DE UM SCFV BLOQUEADOR DA INTEGRINA VLA-4 COMO POTENCIAL BIOFÁRMACO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS CRÔNICAS
Chaves, Beatriz | Fecha del documento:
2019
Autor
Orientador
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumen en portugues
A integrina Α4β1, ou VLA-4, é uma proteína heterodimérica transmembranar presente, principalmente, na superfície de linfócitos T e monócitos. Por mediar a transmigração dessas células a partir do endotélio para o sítio inflamatório, a integrina VLA-4 está criticamente relacionada com a maioria das doenças inflamatórias crônicas, tais como a esclerose múltipla. O Natalizumabe é o único anticorpo terapêutico capaz de reconhecer essa integrina. No entanto, além de não ser específico para a integrina Α4β1, em alguns pacientes, o tratamento com esse anticorpo pode resultar na recrudescência de uma doença chamada leucoencefalopatia multifocal progressiva. Nesse contexto, decidimos produzir um fragmento de anticorpo, do tipo scFv, capaz de reconhecer especificamente a integrina VLA-4 e avaliar sua funcionalidade. A sequência nucleotídica do scFv foi determinada previamente por técnicas de biologia computacional, clonada e expressa em Escherichia coli As moléculas de scFv foram produzidas na forma de corpos de inclusão, solubilizadas em ureia e submetidas à purificação através de cromatografia de afinidade. Após renaturação, a pureza da proteína foi superior a 90 % e o rendimento de 24,6 mg/L. Os ensaios funcionais iniciais demonstraram que o scFv é capaz de promover a adesão de células T da linhagem Jurkat sobre superfícies sensibilizadas com o mesmo, além de reduzir a transmigração dessas células sobre superfície recobertas com ligantes da integrina VLA-4. Experimentos de ELISA (do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) com VLA-4 sugerem que há um reconhecimento da integrina mediado pelo scFv. Experimentos realizados sob fluxo demonstraram que o scFv reduz a frequência de adesão de linfócitos T primários sobre ligantes de VLA-4, mas não altera o perfil de migração ou motilidade dessas células. Além disso, o scFv modulou o padrão de distribuição de fosfo-tirosinas de linfócitos T CD8 ativados por anti-CD3 e fibronectina. Em conjunto, os dados apresentados mostram que o scFv desenvolvido interage com e bloqueia funções da integrina VLA-4, sugerindo potencial utilização desse fragmento de anticorpo para fins terapêuticos.
Resumen en ingles
The α4β1 integrin or VLA-4 (Very Late Antigen 4) is a heterodimeric transmembrane protein mainly found on the surface of T lymphocytes and monocytes. Due to the VLA-4 role in the cell transmigration from the endothelium to the inflammatory site, this integrin is critically related to chronic inflammatory diseases, as Multiple Sclerosis. Natalizumab is the only therapeutic antibody able to recognize this integrin. However, because the unspecificity for α4β1 integrin, in some patients, the Natalizumab application can result in the recrudescence of the Progressive Multifocal Leukoencephalopathy disease. In this context, we decided to produce an scFv antibody fragment able to recognize specifically the VLA-4 integrin and to evaluate its functionality. The scFv nucleotide sequence was previously designed by computational biology tools and then was cloned and expressed in Escherichia coli. The scFv molecules were produced as inclusion bodies, solubilized with buffer containing urea, and submitted to purification through affinity chromatography. After the refolding step, the protein purity was higher than 90 % with a yield of 24.6 mg/mL. After production volume increase, 6 mg of scFv were obtained for the functional evaluation. The first functional assays showed that the scFv could promote the adhesion of T cells (Jurkat lineage), on surfaces coated with the scFv. Besides that, it reduced the transmigration of these cells over surfaces coated with VLA-4 ligands. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) assays suggested that there is an interaction between the scFv and VLA-4. Experiments performed under flow conditions showed that the scFv reduced the adhesion frequency of primary T lymphocytes over VLA-4 ligands, but it does not affect the cell migration or motility profile. Furthermore, the scFv interfered the pattern of distribution of actin and phospho-tyrosine in T CD8+ activated by anti-CD3 and fibronectin. Our data demonstrate that the scFv interacts with the VLA-4 integrin, and blocks some effector functions, indicating a potential application of this antibody fragment for therapeutic strategies.
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