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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/62572
ANÁLISE DE TRÊS PADRÕES DE REFERÊNCIA INTERNACIONAIS FRENTE AOS PROCEDIMENTOS UTILIZADOS EM ENSAIOS DE VIABILIDADE E IDENTIDADE DE VACINA BCG
Faro, Karen Vasconcelos de Farias | Date Issued:
2022
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A tuberculose compreende o grupo das dez doenças que mais matam em países de baixa e média renda. Estima-se que cerca de 10 milhões de pessoas em todo o planeta terão tuberculose anualmente. Para sua prevenção, o Sistema Único de Saúde (SUS) conta com a vacina Bacilo de Calmette e Guérin (BCG). Esta foi desenvolvida em 1921 pelo médico Albert Calmette e pela veterinária Camille Guérin após contínuas passagens da cepa Mycobacterium bovis “Lait Nocard”, responsável por causar mastite tuberculosa bovina. A cepa original do BCG foi distribuída ao redor do mundo para imunização, o que ao longo do tempo culminou no surgimento de subcepas fenotipicamente distintas. Utilizada com objetivo de prevenir principalmente formas graves da tuberculose, a vacina BCG faz parte do calendário do Programa Nacional de Imunizações (PNI) desde 1977. Nesse contexto, o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) é essencial, pois é o órgão responsável por realizar o controle da qualidade das vacinas disponibilizadas pelo PNI, e consequentemente liberá-las para uso pela população brasileira. Em 2017, a vacina preparada com a subcepa Moreau-RJ utilizada no país foi substituída pela vacina preparada com a subcepa Russa BCG-I. Considerando o estabelecimento dos reagentes de referência da OMS de vacina BCG para subcepas NIBSC 10/272), Russa BCG-I (NIBSC 07/274) e Tokyo 172 (NIBSC 07/272), as quais são as subcepas predominantes na produção e distribuição de vacina BCG em todo o mundo, analisou-se estes padrões de referência frente aos procedimentos comumente utilizados no setor a fim de que o laboratório tenha essas informações. Foram realizados ensaios para avaliação da viabilidade por dosagem de trifosfato de adenosina (ATP) e pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em meio Lowenstein-Jensen, e para determinação da identidade por PCR multiplex. Dentre as análises de viabilidade, apenas a dosagem de ATP da subcepa Moreau-RJ (NIBSC 10/272) apresentou resultado esperado conforme o certificado de análise do produtor. Já a identidade por PCR multiplex e por coloração de Ziehl- Neelsen foi satisfatória para os três padrões de referência. Com o uso dos procedimentos empregados na determinação da viabilidade e identidade do BCG em vacinas liofilizadas obteve- se desempenho satisfatório quanto a realização de análise de identidade, porém não atingiu os resultados esperados contidos no certificado de análise de cada um dos padrões de referência internacionais para contagem de UFC. Por outro lado, com relação a dosagem de ATP, método ainda não validado, atingiu-se o esperado apenas para o padrão de referência preparado com a subcepa Moreau-RJ. Todos os ensaios foram satisfatórios para o lote de vacina de referência de trabalho.
Abstract
Tuberculosis comprehends the group of 10 diseases that most kill in low- and middle-income countries. About 10 million people across the world will get tuberculosis each year. For its prevention, the Unified Health System (SUS) counts on the Bacillus Calmette and Guérin (BCG) vaccine. This was developed in 1921 by the doctor Albert Calmette and veterinarian Camille Guérin after continuous passages of the Mycobacterium bovis strain “Lait Nocard”, responsible for causing bovine tuberculous mastitis. The original BCG strain was distributed around the world for immunization, which over time culminated in the emergence of phenotypically distinct substrains. Used mainly to prevent severe forms of tuberculosis, the BCG vaccine has been part of the National Immunization Program (PNI) calendar since 1977. In this context, the National Institute for Quality Control in Health (INCQS) is essential, as it is the organ responsible for carrying out quality control of vaccines made available by the PNI, and consequently releasing them for use by the Brazilian population. In 2017, the vaccine prepared with the Moreau-RJ substrain used in the country was replaced by the vaccine prepared with the Russian BCG-I substrain. Considering the establishment of WHO BCG vaccine reference reagents for substrains NIBSC 10/272), Russian BCG-I (NIBSC 07/274) and Tokyo 172 (NIBSC 07/272), which are the predominant substrains in production and distribution of BCG vaccine worldwide, these reference standards were analyzed against the procedures commonly used in the sector so that the laboratory has this information. Assays were performed to determined viability by the adenosine triphosphate (ATP) content and by counting colony forming units (CFU), and to determine identity by multiplex PCR and Ziehl-Neelsen staining. For the viability assay by counting CFU and by ATP content of the Moreau-RJ substrain, was observed the presence of 5.34 x 106 CFU/ml and 17.91 ng/ml ATP, respectively. For the Russian substrain, the value found was 1.78 x 106 CFU/ml and 3.15 ng/ml of ATP. For the Tokyo substrain, the viability test by CFU could not be performed due to insufficient ampoules in this department, but the ATP content value was 63.94 ng/ml. Among the viability analyses, only the ATP dosage for the NIBSC 10/272 MoreauRJ substrain showed the expected result according to the WHO package insert. The procedures used to determine the viability and identity of BCG in lyophilized vaccines, satisfactory performance was obtained regarding the performance of identity analysis, but it did not reach the expected results contained in the certificate of analysis of each of the international reference standards for CFU count. Otherwise, regarding ATP dosage, a method not yet validated, the expected was reached only for the reference standard prepared with the Moreau-RJ substrain. All assays were satisfactory for the working reference vaccine lot.
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