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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/7189
PADRONIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA O VÍRUS DE FEBRE AMARELA VACINAL E CINÉTICA DE REPLICAÇÃO VIRAL IN VITRO
Fernandes, Alice Gomes | Date Issued:
2012
Alternative title
Standardization and validation of method for RT-PCR real time to yellow fever virus vaccine and kinetics of viral replication IN VITROAuthor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ.
Abstract in Portuguese
O desenvolvimento e a produção de vacinas virais, de uma forma geral,envolvem diversas etapas que necessitam do monitoramento da carga viral ao longo de todo processo. Essas etapas vão desde a produção do antígeno,
purificação, inativação, liofilização, testes pré-clínicos e clínicos e uma vez o produto licenciado, um processo de farmacovigilância contínuo se faz necessário. Atualmente em Biomanguinhos essas etapas são monitoradas pelo ensaio de titulação em placa de lise que leva em torno de sete a dez dias. Com o recente desenvolvimento do qRT-PCR em tempo real (qRT-PCR), temos disponível uma abordagem mais rápida para este monitoramento, que pode ser feito em poucas horas. Dentro deste contexto, desenvolver, padronizar e validar uma técnica que permita quantificar o vírus da febre amarela de forma rápida e eficaz em todas as etapas acima descritas é de extrema importância na otimização deste processo. Para tal foi construída uma curva padrão plasmidial e parâmetros como linearidade, precisão intermediária e especificidade foram avaliados. Além disso, foi definido o limite de detecção e quantificação do teste. Para garantir a qualidade do teste foram estabelecidos controles exógenos e endógenos, a fim de evitar resultados falso negativos. A análise estatística dos dados de quantificação viral, nos revelam uma excelente correlação entre os resultados obtidos em cópias de RNA/mL quantificados por qRT-PCR e o título viral calculados em ensaios de plaque (R = 0.96), além da obtenção de um fator de correlação, para conversão dos valores de PCR em tempo real para plaque. A análise dos resultados demonstrou que os experimentos da validação atendem a todos os parâmetros definidos pelo setor de qualidade. Esta técnica se mostrou eficiente para determinação da carga viral do vírus da febre amarela tanto em amostra in vivo quanto in vitro, tornando-se assim uma ferramenta muito importante em todos os projetos
desenvolvidos no LATEV e podendo inclusive, no futuro ser adotada como padrão ouro nas análises laboratoriais e de controle de qualidade dos lotes vacinais.
Abstract
The development and the production of viral vaccines, in general, involve several steps that need the monitoring of viral load throughout the entire process. These steps range from the production of antigen, purification, inactivation,lyophilization, preclinical testing and clinical trials and once the licensed product,a process of continued pharmacovigilance is needed. Nowadays in Biomanguinhos these steps are monitored by plaque titration assay lysis which takes about seven to ten days. With the recent development of real time RT-PCR, we have available a faster approach to this, where monitoring can be done in a few hours. In this context, the development, standardization and validation of a technique to quantify the yellow fever virus quickly and efficiently in all the stages described above is extremely important in optimizing the process. To do this end we constructed a plasmid standard curve and parameters such as linearity,intermediate precision and specificity were evaluated. Furthermore, we defined the limit of detection and quantification of the test. To ensure the quality of the test, endogenous and exogenous controls were established in order to avoid
false negative results. The statistical analysis to quantify viral load revealed an excellent correlation between the results obtained in RNA copies / mL quantified by qRT-PCR and the viral titer calculated as plaque tests (R = 0.96). In addition, a correlation factor for conversion of the real time PCR data to plaque was generated. In general, the results analysis showed that the validation experiments gathered to all parameters defined by the quality sector. The technique herein standardized proved to be effective for determining yellow fever viral load both in vivo and in vitro, thus becoming a very important tool in all projects developed in LATEV, and may eventually be adopted as the gold standard laboratory analysis and quality control for vaccine production.
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