FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS DOUTORADO EM PESQUISA CLÍNICA EM DOENÇAS INFECCIOSAS ARLEANA DO BOM PARTO FERREIRA DE ALMEIDA OCORRÊNCIA DE Leishmania chagasi E OUTROS TRIPANOSOMATÍDEOS EM CÃES DE CUIABÁ, MATO GROSSO: AVALIAÇÃO CLÍNICA E USO DE DIFERENTES MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL RIO DE JANEIRO 2012 i OCORRÊNCIA DE Leishmania chagasi E OUTROS TRIPANOSOMATÍDEOS EM CÃES DE CUIABÁ, MATO GROSSO: AVALIAÇÃO CLÍNICA E USO DE DIFERENTES MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ARLEANA DO BOM PARTO FERREIRA DE ALMEIDA Rio de Janeiro 2012 Tese apresentada ao curso de Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas para obtenção do grau de Doutor em Ciências. Orientado por Maria de Fatima Madeira e Valéria Régia Franco Sousa ii ARLEANA DO BOM PARTO FERREIRA DE ALMEIDA OCORRÊNCIA DE Leishmania chagasi E OUTROS TRIPANOSOMATÍDEOS EM CÃES DE CUIABÁ, MATO GROSSO: AVALIAÇÃO CLÍNICA E USO DE DIFERENTES MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Tese apresentada ao curso de Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas para obtenção do grau de Doutor em Ciências. Orientadores: Dra. Maria de Fatima Madeira Dra. Valéria Régia Franco Sousa Banca examinadora _______________________________________________ Dr. Fabiano Borges Figueiredo (Presidente) IPEC/Fiocruz _______________________________________________ Dr. Rodrigo Caldas Menezes (Componente) IPEC/Fiocruz _______________________________________________ Dra. Teresa Cristina Bergamo do Bonfim (Componente) UFRRJ _______________________________________________ Dra. Cibele Baptista (Componente) Biomanguinhos/Fiocruz _______________________________________________ Dra. Flavia Coelho Ribeiro (Componente) EPSJV/Fiocruz _______________________________________________ Dr. Sandro Antônio Pereira (Suplente) IPEC/Fiocruz iii AGRADECIMENTOS A Deus pelo cuidado e sustento. Aos meus familiares, especialmente a minha mãe Maria da Glória Ferreira pelo exemplo, dedicação e amor. Aos meus avós por serem o esteio da família e aos meus irmãos pela convivência e ajuda. As minhas orientadoras, Dra. Maria de Fatima Madeira e Prof. Dra. Valéria Régia Franco Sousa. Obrigada pelos ensinamentos, orientação, carinho e dedicação. Agradeço imensamente a Deus pela benção de poder conhecê-las e conviver com vocês, pois apesar de personalidades diferentes, são exemplos que guardarei por toda minha vida. Ao Médico Veterinário Dr. Fabiano Borges Figueiredo pelo “ponta pé inicial” e auxílio no decorrer do doutorado. As amigas, companheiras de residência, mestrado e doutorado: Eveline da Cruz Boa Sorte, Wilma Neres, Mariana de Medeiros Torres, Thaís Ruiz, Magyda Arabia Araji Dahroug, Daphine Ariadne Jesus de Paula, Isadora Vila, Naiani Domingos Gasparetto, Glaucenyra Cecília Pinheiro, pelos momentos de descontração, gargalhadas, trabalho árduo e, por que não mencionar, tristezas ao longo de todos esses anos. Aos Médicos e Médicas Veterinárias Maria Fernanda Aranega Pimentel, Eveline da Cruz Boa Sorte, Magyda Arabia Araji Dahroug, Naiani Domingos Gasparetto, Felipe Augusto Constantino Seabra da Cruz, Givago Silva Faria e ao técnico Valdir Campos pelo auxílio no trabalho de campo, tornando-as mais fáceis e prazerosas!!!!!! Aos bolsistas de iniciação científica do Laboratório de Leishmanioses (HOVET- UFMT): Juliana Yuki Rodrigues, Nayara Benites Moreira, Pamela Hensi, Álvaro Felipe pelo auxílio no trabalho de campo e laboratorial. iv Ao Prof. Dr. Luciano Nakazato e a Profa. Dra. Valéria Dutra, estagiários, mestrandos e doutorandos do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, nos nomes de Marcelo Marques da Silveira, Isabela de Godoy, João Xavier, Carla Patrícia Amarante e Silva, Janaina Marcela Assunção Rosa, em especial a Daphine Ariadne Jesus de Paula, pela amizade e por toda ajuda no desenvolvimento do projeto. A Profa. Adriane Jorge Mendonça e membros do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária, Maria do Carmo Aragão, Laura Cristina Araújo, Isadora Vila, Vanessa Suzila, Felipe Jaune, por terem proporcionado o desenvolvimento do projeto ao ceder espaço no laboratório, e acima de tudo pela ajuda, companhia, risadas. A equipe HOVET-UFMT, membros do setor administrativo (Rosiane, Taislayne, Ana Rita, Ravi), técnicas de enfermagem (Edna, Regina, Anália, Marlene), técnicos (Domingas, Juarez, Gisele, Suen, Ramirie), mestrandos, residentes, estagiários, pessoal do serviço geral (Joilson, Edinéia) que sempre me ajudaram, proporcionando ambiente familiar, composto de muita solidariedade, fraternidade e alegria. Obrigada por tornarem meus dias mais alegres!!!!!!!!! Aos membros do Laboratório de Vigilância em Leishmanioses e Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do IPEC/FIOCRUZ pelo auxílio na execução deste projeto. Ao IPEC/FIOCRUZ e FAPEMAT pelo apoio financeiro. Em especial a todos os proprietários e seus cães (meus pacientes) que gentilmente aceitaram participar deste projeto. A receptibilidade e o carinho com que fomos recebidos são motivações a continuar trilhando o caminho da pesquisa. A todos que de alguma forma me auxiliaram no desenvolvimento deste projeto, seja por auxílio laboratorial, científico, palavras de apoio, incentivo, pois sei que sem a ajuda de vocês essa tese não teria chegado ao final. A vocês meu MUITO OBRIGADA!!! v Almeida, ABPF. Ocorrência de Leishmania chagasi e outros tripanosomatídeos em cães de Cuiabá, Mato Grosso: avaliação clínica e uso de diferentes métodos de diagnóstico laboratorial. Rio de Janeiro, 2012. 147 f. Tese [Doutorado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas] Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. RESUMO Na cidade de Cuiabá, o conhecimento de aspectos da leishmaniose visceral canina (LVC) é ainda muito escasso, apesar de casos humanos serem relatados nessa cidade. Este estudo objetivou avaliar clinicamente e por diferentes métodos laboratoriais cães domésticos domiciliados em áreas urbana e rural, no município de Cuiabá, Mato Grosso. Os animais foram selecionados por meio de busca ativa em cinco bairros e por demanda espontânea durante atendimento no hospital veterinário da UFMT. Os cães foram avaliados por ferramentas sorológicas, parasitológicas e moleculares, empregando diferentes amostras biológicas. Dos 430 cães obtidos por busca ativa, 95 (22,1%) foram reatores pela imunofluorescência indireta. Esse dado foi considerado para análise dos fatores de risco e, tanto aspectos relacionados ao hábito dos animais (livre acesso à rua e função de guarda), assim como do ambiente (rural e presença de plantações) foram considerados como fatores de risco importantes para a aquisição da infecção canina. A cultura parasitológica, utilizando amostras dos 430 cães oriundos do inquérito epidemiológico e 52 do atendimento no HOVET-UFMT, permitiu o isolamento de L. chagasi em 54 (11,2%) cães. A pele intacta foi a melhor amostra biológica de isolamento do parasito em cães sintomáticos, porém nos cães assintomáticos, a melhor amostra para isolamento foi a medula óssea. Por PCR, utilizando apenas os cães da busca ativa, DNA de L. chagasi foi detectada em diferentes amostras biológicas, diagnosticando 63 (14,6%) dos cães. O aspirado de linfonodo foi a melhor amostra para diagnosticar leishmaniose, pela PCR, independente do status clínico dos animais. O protozoário Trypanosoma caninum foi isolado exclusivamente de pele integra em 14 cães, demonstrando a presença desta espécie pela primeira vez em Cuiabá. Nossos resultados sugerem que a infecção por esse parasito, possa ser transitória e curse sem sinais clínicos específicos. Além de T. caninum, a infecção por T. cruzi em um cão foi também descrita na cidade de Cuiabá. Os resultados apresentados neste estudo contribuem para o conhecimento de aspectos da LVC em Cuiabá. Esta cidade possui características propícias para a instalação da leishmaniose visceral, sendo necessária inclusão de ações educacionais e sanitárias. Com relação ao diagnóstico canino, enfatizamos que a utilização de diferentes amostras clínicas, associadas a diferentes técnicas laboratoriais, proporcionam um diagnóstico acurado da LVC e auxiliam o diagnóstico diferencial com outros agentes que estejam circulando nesses animais. A infecção por L. chagasi, T. caninum e T. cruzi diagnosticados em cães domiciliados em Cuiabá demonstram a sobreposição de tais agentes, constituindo dados importantes para a vigilância epidemiológica nessa região. Palavras-chave: Leishmania chagasi, Trypanosoma caninum, Trypanosoma cruzi, cão, diagnóstico, Cuiabá, Mato Grosso vi Almeida, ABPF. Occurrence of Leishmania chagasi and other trypanosomatids in dogs in Cuiabá, Mato Grosso: clinical evaluation and use of different methods of laboratory diagnosis. Rio de Janeiro, 2012. 147f. Tese [Doutorado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas] Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. ABSTRACT In Cuiabá, knowledge of aspects of canine visceral leishmaniasis (CVL) is still very scarce, although human cases are reported. This study evaluated clinically and by laboratory methods, domestic dogs from urban and rural areas in the city. The animals were selected through active search in the five boroughs and spontaneous demand for care at the veterinary hospital (UFMT). The animals were evaluated by serological, parasitological and molecular approach, using different biological samples. Of the 430 dogs from active search, 95 (22.1%) were reactive in indirect immunofluorescence. These data were considered for analysis of risk factors and both aspects related to the habit of animals (free street access and guard function). The environment (rural and presence of agricultural activities) were considered important risk factors for acquisition of canine infection. The parasitological culture, from 430 dogs from an epidemiological survey and 52 treated at HOVET-UFMT, allowed the isolation of L. chagasi in 54 (11.2%) dogs. Intact skin was the best biological sample isolation of the parasite in symptomatic dogs, however, in asymptomatic dogs, the best biological sample for isolation was bone marrow. For PCR, DNA L. chagasi was detected in 63 (14.6%) animals, using different biological samples from dogs search active. The lymph node aspirate was the best biological sample to diagnose leishmaniasis by PCR, regardless of the clinical status of the animals. The protozoan Trypanosoma caninum was isolated exclusively intact skin in 14 dogs, demonstrating the presence of this species for the first time in Cuiabá. Our results suggest that infection by T. caninum can be transient and curse without specific clinical signs. Besides T. caninum, infection with T. cruzi in a dog was also reported in the city of Cuiabá. The results presented in this study contribute to the knowledge of aspects of LVC in Cuiabá. This city has favorable characteristics for the installation of visceral leishmaniasis, necessitating the inclusion of education and health actions. Regarding the diagnosis canine, we emphasize that the use of different clinical samples associated with different laboratory techniques, provide an accurate diagnosis of CVL and assist the differential diagnosis with other agents that are circulating in these animals. Infection with L. chagasi, T. caninum and T. cruzi diagnosed in pet dogs in Cuiabá demonstrate the overlap of these agents, providing important data for epidemiological surveillance in the region. Keywords: Leishmania chagasi, Trypanosoma caninum, Trypanosoma cruzi, dog, diagnostic, Cuiabá, Mato Grosso vii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS CanL – Canine Leishmaniasis / Leishmaniose canina CEUA– Comissão de Ética no Uso de Animais DNA – Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucléico DPP – Dual Path Plataforma / Teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay / Ensaio imunoenzimático g – grama HOVET-UFMT – Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso IFI – Imunofluorescência Indireta IPEC/FIOCRUZ – Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas/Fundação Oswaldo Cruz kDNA – Kinetoplast Deoxyribonucleic acid / DNA do cinetoplasto LAPCLIN-DERMZOO – Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos LT – Leishmaniose Tegumentar LV – Leishmaniose Visceral LVC – Leishmaniose Visceral Canina ml - mililitro MS – Ministério da Saúde MLEE - Multi-locus enzyme electrophoresis / Eletroforese de isoenzimas NNN – Meio de cultura de Novy, Nicolle e McNeal OR – Odds ratio / Razão de chances PCR – Reaction chain polymerase / Reação em Cadeia da Polimerase rDNA – Ribosomal Deoxyribonucleic acid / DNA ribossomal rpm – rotações por minuto RS – Rio Grande do Sul SC – Santa Catarina Sin – Sinonímia UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso VigiLeish – Laboratório de Vigilância em Leishmanioses WHO – World Health Organization / Organização Mundial da Saúde viii LISTA DE FIGURA E TABELAS Figura 1. Localização espacial dos bairros pesquisados para a ocorrência de leishmaniose visceral canina na cidade de Cuiabá, Mato Grosso. 27 Figura 2. Fluxograma apresentando as etapas do estudo, identificando as amostras biológicas coletadas dos animais e os ensaios laboratoriais empregados nas análises 33 Tabela 1: Especificação dos alvos moleculares que foram utilizados neste estudo 30 1 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................... 2 1.1. ASPECTOS GERAIS DAS LEISHMANIOSES ...................................................................................................... 2 1.2. AS LEISHMANIOSES NO ESTADO DE MATO GROSSO ....................................................................................... 3 1.3. LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA (LVC) ..................................................................................................... 5 1.4. DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA ...................................................................................... 8 1.5. FATORES DE RISCO ASSOCIADOS AS LEISHMANIOSES......................................................................................10 1.6. TRIPANOSOMATÍDEOS DE OCORRÊNCIA EM CÃES DOMÉSTICOS ........................................................................11 2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................................................16 3. OBJETIVOS ............................................................................................................................................18 3.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................................18 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..............................................................................................................................18 4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................................................19 4.1. DESENHO DO ESTUDO E POPULAÇÃO ALVO .......................................................................................................19 4.2. ÁREA DE ESTUDO ......................................................................................................................................19 4.3. ANIMAIS E COLETA DE AMOSTRAS .................................................................................................................20 4.4. ENSAIOS EMPREGADOS NO ESTUDO ...............................................................................................................22 4.4.1. Testes sorológicos ........................................................................................................................22 4.4.2. Isolamento parasitário em meio de cultura ...................................................................................22 4.4.3. Exame citológico ..........................................................................................................................23 4.4.4. Testes moleculares .......................................................................................................................23 4.4.5. Sequenciamento molecular ............................................................................................................24 4.4.6. Eletroforese de enzimas (MLEE) ...................................................................................................25 4.5. ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA E VARIÁVEIS ESTUDADAS ............................................................................................26 4.6. ANÁLISE DOS RESULTADOS ...........................................................................................................................27 4.7. PROCEDIMENTO ÉTICO ...............................................................................................................................28 5. RESULTADOS .......................................................................................................................................29 5.1 - ARTIGO 1 ...............................................................................................................................................30 5.2 - ARTIGO 2 ...............................................................................................................................................37 5.3 - ARTIGO 3 ...............................................................................................................................................43 5.4 - ARTIGO 4 ...............................................................................................................................................61 5.5. ARTIGO 5 ...............................................................................................................................................81 5.6. ARTIGO 6 ............................................................................................................................................. 103 6. DISCUSSÃO GERAL .......................................................................................................................... 116 7. CONCLUSÕES .................................................................................................................................... 124 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................. 125 9. ANEXOS .............................................................................................................................................. 143 9.1. LICENÇA CEUA ...................................................................................................................................... 143 9.2. FICHA EPIDEMIOLÓGICA ............................................................................................................................ 145 2 1. INTRODUÇÃO 1.1. Aspectos gerais das Leishmanioses Leishmaniose compreende uma entidade de doenças causadas por protozoário flagelado do gênero Leishmania, que acometem o homem e diferentes espécies de animais. A doença ocorre em regiões tropicais e subtropicais do Velho e do Novo Mundo, causando duas formas clínicas principais, a Leishmaniose Tegumentar (LT) e a Leishmaniose Visceral (LV) (WHO, 2012). Dados da Organização Mundial da Saúde estimam que 1,0 a 1,5 milhões de casos de LT e 500 mil novos casos de LV ocorram por ano. A população sob risco de leishmaniose é estimada em 350 milhões de pessoas, afetando 88 países, dos quais 72 são classificados como países em desenvolvimento, incluindo 13 dos países menos desenvolvidos. Dos casos de LV diagnosticados, mais de 90% ocorrem em Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil (WHO, 2012). A LV, no Brasil é descrita desde 1913 e possui como agente etiológico a Leishmania (Leishmania) chagasi (sin. L. (L.) infantum). É uma doença crônica, de caráter endêmico, caracterizada principalmente por emagrecimento progressivo, anemia, episódios febris e hepatoesplenomegalia, cuja severidade depende normalmente do tempo de evolução da doença. Em território brasileiro é registrada em 21 das Unidades da Federação, atingindo as cinco regiões brasileiras (MS, 2012c). Recentemente, na região sul do país, onde não havia registro da doença, foram relatados casos caninos autóctones na cidade de São Borja (RS), demonstrando a expansão da doença (Souza et al., 2009a; MS, 2010a). No período de 2006 a 2010 foram registrados 18.168 casos de LV no país com 1083 óbitos, sendo a região nordeste (47,1%) e norte (18%) as regiões com maior registro de casos (MS, 2012b; MS, 2012d). 3 O ciclo de transmissão da LV envolve canídeos (silvestres e domésticos), marsupiais e roedores, como principais reservatórios. O flebotomíneo Lutzomyia longipalpis é considerado o principal vetor nas Américas (Dantas-Torres et al., 2012), no entanto, L. cruzi, L. evansi e L. migonei têm sido propostos como potenciais vetores de L. chagasi em países sul americanos, incluindo o Brasil (Souza et al., 2003; Carvalho et al., 2010; Salomon et al., 2010; Missawa et al., 2011; Dantas-Torres et al., 2012). Atualmente, a doença encontra-se urbanizada, ocorrendo em grandes cidades, mantidas principalmente pela presença de cães infectados e flebotomíneos adaptados a estes ambientes (Silva et al., 2001; Marzochi et al., 2009). Acredita-se que L. chagasi tenha sido introduzida no país durante a colonização européia, através de cães infectados e aqui tenha se adaptado a novos vetores e hospedeiros (Shaw, 2002). Tal hipótese está baseada na semelhança genética, bioquímica e molecular entre L. infantum e L. chagasi (Momen et al., 1993; Mauricio et al., 1999). Recentemente estudos utilizando tipagem de multilocus por microssatélites apoiam esta hipótese (Kuhls et al., 2011; Leblois et al., 2011). 1.2. As Leishmanioses no Estado de Mato Grosso Em Mato Grosso a LV possui caráter endêmico, sendo os primeiros registros da doença humana realizados na década de setenta na região sudeste do estado (Baruffa e Cury, 1973). No início da década de noventa em municípios da região centro-sul foram registrados mais quatro casos autóctones (Hueb et al., 1996). A demonstração da expansão da LV por todo o estado e principalmente para a capital e municípios próximos ocorreu a partir de 1998, após o diagnóstico de um paciente de Várzea Grande, cidade vizinha à Cuiabá (Camiá et al., 1999). Trabalho realizado por Mestre e Fontes (2007) descreve a expansão e aumento da doença no estado, com 34 municípios notificados com doença e 138 novos casos humanos no período de 1998 a 2005. 4 Mato Grosso é considerado região endêmica tanto para LV quanto para LT, apresentando aumento no número de notificação de ambas as doenças. Em 2010 foram notificados 54 casos de LV e 2466 de LT (MS, 2012a; MS, 2012b). Cuiabá é considerada área de transmissão moderada para LV, sendo registrados 22 casos humanos no período de 2005 a 2011, com relato de um óbito (CCZ, 2012). Pela severidade da LV no homem, as ações sanitárias para esta forma da doença são mais rigorosas que aquelas direcionadas à forma tegumentar. Assim, programas de controle são implantados nas áreas endêmicas, objetivando interromper o ciclo de transmissão. Tais programas assumem três pontos principais: diagnóstico e tratamento dos casos humanos; monitoramento da fauna flebotomínica e detecção de casos caninos, realizando eutanásia dos animais sororeatores (MS, 2006). No Brasil, estes programas iniciaram-se por volta da década de 50 durante um surto ocorrido no Estado do Ceará, estendendo-se mais tarde para outras regiões do país. No estado de Mato Grosso, o primeiro inquérito sorológico canino foi realizado em Cuiabá, em 1999, onde se observou índices de prevalência de 64,5% dos cães (Moura et al., 1999). Mestre e Fontes (2007) ao analisarem dados de inquéritos caninos realizados em áreas urbanas e periurbanas de 49 municípios de Mato Grosso, no período de 1998 a 2005, relataram uma prevalência de 9% nos 40.000 cães testados. O município de Jaciara foi o que apresentou maior prevalência (40%) e em Cuiabá, verificou-se 8,4% dos cães positivos. A partir destes estudos, pesquisas visando identificar a prevalência da infecção canina, da fauna flebotomínica e agente etiológico, além da ocorrência de casos humanos vêm sendo realizados no estado de Mato Grosso. A soroprevalência de cães infectados tem sido variável, dependendo do período e área estudada. São descritos índices de 3,4%; 26,8% a 48,4% em áreas com registros de aumento do número de casos (Almeida et al., 2009; Duarte, 2010; Mestre et al., 2011). Missawa et al. (2010) demonstraram infecção de L. 5 longipalpis por L. chagasi em Várzea Grande, município considerado de transmissão intensa no ano de 2003 (MS, 2006). Entretanto, L. cruzi tem sido a espécie mais prevalente em diversas áreas endêmicas de LV no estado (Duarte, 2010; Mestre et al., 2011), sendo sua infecção natural por L. chagasi recentemente comprovado (Missawa et al., 2011). 1.3. Leishmaniose visceral canina (LVC) Diferentemente do que ocorre no ciclo de transmissão da LT, onde se desconhece o potencial do cão doméstico como reservatório, na LV, esse animal possui um papel já bem sedimentado, sendo considerado um importante reservatório doméstico de L. chagasi (Dantas-Torres, 2007; Dantas-Torres et al., 2012). No contexto epidemiológico da urbanização da LV, o cão possui grande importância na manutenção e dispersão da doença, sendo um dos principais alvos nas ações de controle (MS, 2006). No Brasil, apesar do primeiro caso canino ter sido descrito em 1938 (Chagas et al., 1938), foi a partir dos relatos de Deane e Deane, em 1955, que constataram a presença de formas amastigotas na pele de cães infectados, facilitando a infecção pelos vetores. Portanto, esses autores passaram a incriminar o cão como um dos prováveis elos no ciclo de transmissão no ambiente doméstico. Desde então, a notificação de cães infectados em áreas endêmicas, associado ao aparecimento dos casos humanos, tem sugerido que o cão infectado possa manter e amplificar ciclos instalados no peridomicílio (Alencar e Cunha, 1963; Alencar, 1978; Marzochi et al., 1985a,b; Paranhos-Silva et al., 1998; Marzochi et al., 2009). Dessa forma, os órgãos sanitários competentes passaram a adotar medidas objetivando a interrupção desse ciclo de transmissão, através da detecção e eutanásia dos cães sororeatores (MS, 2006). Inquéritos sorológicos caninos vêm sendo realizados, em todo o Brasil, não só para o controle da doença, mas também para o conhecimento da dimensão da LV no país e do envolvimento do cão na cadeia epidemiológica (Alves et al., 1998; Moura et al., 1999; 6 Nunes et al., 2001; Cabrera et al., 2003; Savani et al., 2003; Silva e Rosa, 2005; Monteiro et al., 2005; Almeida et al., 2009). Tais pesquisas demonstraram o surgimento de casos da doença em áreas anteriormente indenes para LV, como a região sul do Brasil, onde cães foram encontrados parasitados por L. chagasi em São Borja (RS) e Florianópolis (SC) (Souza et al., 2009a; Figueiredo et al., 2012). Segundo Cowell et al. (2011) os cães são considerados elementos de dispersão de certas zoonoses, pois são animais frequentemente deslocados entre diferentes áreas, podendo carrear agentes etiológicos de importantes doenças. Para Figueiredo et al. (2012) a tentativa de alguns proprietários burlarem a principal metodologia de controle, ou seja, a eutanásia de cães sororeatores, acabam transferindo seus animais para áreas não endêmicas, onde a realização de inquérito sorológico não é praticado, colocando em risco a população dessas áreas. O quadro clínico da leishmaniose visceral canina (LVC) é bastante variável, apresentando-se desde aparente estado sadio a quadros graves de caquexia associada a outras complicações (Marzochi et al., 1985b; Alvar et al., 2004; Miró et al., 2008; Paradies et al., 2010). De acordo com Saridomichelakis (2009), os parasitos podem ser eliminados localmente na pele, acarretando em infecção autolimitante; podem ser sequestrados na pele e linfonodo, resultando em infecção não disseminada ou usualmente assintomática ou ainda, disseminar-se por todo o corpo, ocasionando casos sintomáticos ou assintomáticos, dependendo da susceptibilidade do animal. Baneth et al. (2008) descrevem que o curso clínico da infecção por Leishmania sp. em áreas endêmicas pode estar relacionado a ocorrência e ao número de picadas do vetor, as espécies de Leishmania envolvidas; predisposição genética e da resposta imune do animal. Os sinais clínicos mais comuns nos cães são as alterações cutâneas (alopecia, dermatites, descamações, úlceras cutâneas, onicogrifose); sinais oculares (conjuntivite, ceratoconjuntivite, uveite); linfoadenopatia local ou generalizada; anemia, febre e 7 hepatoesplenomegalia (Marzochi et al., 1985b; Genaro et al., 1988; Silva et al., 2001; Alvar et al., 2004; Reis et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2009). De acordo com a ausência ou presença de um ou vários destes sinais clínicos, os animais podem ser classificados como assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos (Mancianti et al., 1988; Abranches et al., 1991). Em áreas endêmicas a prevalência de cães assintomáticos tem demonstrado ser superior a dos sintomáticos (Dantas-Torres et al., 2006; Almeida et al., 2009). Segundo Paradies et al. (2010) tal característica pode estar associado a possível resistência canina, tendo em vista a não progressão clínica observada em alguns cães de seu estudo. Entretanto, epidemiologicamente, é importante ressaltar que em todas essas fases o animal apresenta intenso parasitismo cutâneo, servindo de fonte de infecção para os insetos vetores (Travi et al., 2001). A ampla diversidade de sinais clínicos apresentados por estes animais e a grande porcentagem de cães assintomáticos torna o diagnóstico clínico da doença um grande desafio em áreas endêmicas (Ikeda-Garcia e Feitosa, 2006). Na LVC, a distribuição do parasito pode ser extensiva, alcançando órgãos como baço, fígado, linfonodos, pele, medula óssea, dentre outros (Alvar et al., 2004; Reis et al., 2009; Saridomichelakis, 2009), diferente do que ocorre no homem onde o parasito é normalmente limitado à medula óssea, baço e fígado (Swenson et al., 1988). A eutanásia de cães sororeatores é uma das recomendações de controle para LV no Brasil (MS, 2006). No entanto, tal medida tem gerado discussões por não conter o avanço da doença, gerando questionamentos quanto ao papel desses animais no ciclo de transmissão (Costa, 2011; Dantas-Torres et al., 2012). Estratégias alternativas no controle têm sido propostas, desde diferentes protocolos terapêuticos para o cão (Tassi et al., 1994; Slappendel e Teske, 1997; Rougier et al., 2012), uso de coleiras impregnadas com inseticida (Killick- Kendrich et al., 1997) ao desenvolvimento de vacinas (Da Silva et al., 2000; Borja-Cabrera et al., 2002). Entretanto, tais alternativas, devem ser tratadas com cautela, pois devem 8 considerar diferentes aspectos, desde custos, praticidade de aplicação em larga escala e eficácia. Mesmo não aceito pela população, permanece a prática da eutanásia de cães sororeatores, como uma das medidas de controle da LV. 1.4. Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina Na LVC, a presença do parasito nos mais diferentes tecidos e órgãos provocam reações características da doença, entre as quais a ativação policlonal de linfócitos B, produzindo elevados níveis séricos de imunoglobulinas. Se por um lado esses altos níveis de anticorpos não possuem significado de proteção, por outro, facilita o diagnóstico laboratorial através de testes sorológicos (MS, 2006). Por muitos anos a imunofluorescência indireta (IFI) foi o método recomendado pelo Ministério da Saúde para o diagnóstico confirmatório da infecção canina, considerando positivos cães com títulos de anticorpos ≥ 1:40 (MS, 2006). Além da IFI, diversas outras técnicas sorológicas têm sido comumente usadas no diagnóstico da LVC, como ensaio imunoenzimático (ELISA), teste de aglutinação direta e testes imunocromatográficos (Alvar et al., 2004). Os testes imunocromatográficos cada vez mais têm sido utilizados por possuírem operação local, apresentando alta sensibilidade e especificidade, serem de fácil uso e não requererem estrutura laboratorial (Reithinger e Dujardin, 2007; Srivastava et al., 2011). Antígenos recombinantes de L. chagasi (rK9, rK26 e rK39) têm sido utilizados em ensaios imunoenzimáticos apresentando alta sensibilidade e especificidade no diagnóstico de LV humana e canina (Lima et al., 2010; Mohapatra et al., 2010). Recentemente, o teste imunocromatográfico Dual path plataforma (DPP) foi introduzido na rotina diagnóstica durante os inquéritos caninos, atuando como um teste de triagem (MS, 2011). Grimaldi Jr et al. (2012) ao analisar tal teste observaram alta especificidade (96%) e alta sensibilidade (98%) em cães sintomáticos. Entretanto nos casos assintomáticos o teste demonstrou baixa sensibilidade (47%). Segundo Reis et al. (2006), 9 altos títulos de anticorpos está associada com elevado parasitismo e doença. Embora na presença de baixos níveis de anticorpos é importante acompanhamento com outras técnicas para confirmar a infecção (Miró et al., 2008). Um dos pontos considerados crítico na utilização de técnicas sorológicas é a possibilidade de reações cruzadas com outros agentes tripanosomatídeos (Vexenat et al., 1996; Luciano et al., 2009; Silva et al., 2011; Alves et al., 2012), principalmente em áreas de sobreposição. Apesar de frequentemente o diagnóstico de LVC se basear em análises sorológicas, a confirmação da infecção a partir da demonstração do parasito é importante. Isto pode ser feito em material biológico como aspirado de linfonodo, baço, fígado e medula óssea (Marzochi et al., 1985b; Genaro et al., 1988; Maia et al., 2009), empregando métodos parasitológicos clássicos (citologia e isolamento em meio de cultura) (Souza et al., 2009a; Srivastava et al., 2011). Outras metodologias como a análise histopatológica e imuno- histoquímica (IHQ), também tem sido utilizadas como uma alternativa para o diagnóstico (Moreira et al., 2007; Calabrese et al., 2010; Figueiredo et al., 2010). A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método sensível e específico na detecção de DNA de Leishmania sp. em uma variedade de amostras clínicas, sendo mais sensível que os métodos sorológicos e parasitológicos convencionais (Maia et al., 2009; Pandey et al., 2010; Coura-Vital et al., 2011). Além disso, possibilita a diferenciação das espécies de Leishmania envolvidas na infecção através da utilização de oligonucleotídeos específicos ou por enzimas de restrição (Andrade et al., 2006; Gomes et al., 2008; Quaresma et al., 2009). A PCR quantitativa, além de apresentar maior sensibilidade em comparação à PCR qualitativa, possibilita diagnóstico mais acurado, evolução clínica do animal, e avaliação da efetividade terapêutica (Francino et al., 2006; Tupperwar et al., 2008; Maia et al., 2010). Apesar de mais sensível, a PCR não costuma ser 10 utilizada na rotina diagnóstica de cães, sendo indicada em situações especiais como uma ferramenta útil na confirmação de casos duvidosos. Em virtude da dificuldade encontrada no diagnóstico da LVC, principalmente nos cães assintomáticos, a utilização de diferentes amostras biológicas, bem como de técnicas com princípios distintos é de suma importância na correta identificação da infecção (Paradies et al., 2010; Dantas-Torres et al., 2012). 1.5. Fatores de risco associados as Leishmanioses Na epidemiologia da LV humana, estão relacionados fatores individuais, como a idade, status nutricional e fatores ambientais. Idade inferior a cinco anos foi considerado fator de propensão a doença (Evans et al.,1992), com risco em torno de 11,4 vezes maior quando comparado a população adulta (Thompson et al., 2002). Entretanto, alguns estudos não descrevem associação significativa para esta variável (Ranjan et al., 2005). A proximidade das residências a vegetação e presença de outros animais no peridomicílio também tem sido um fator associado à doença humana e canina (Evans et al., 1992; Thompson et al., 2002; Borges et al., 2009). Residências com cobertura de palha, paredes de barro e sem piso apresentaram fatores de risco em alguns estudos (Ranjan et al., 2005), assim como o acúmulo de lixo nas proximidades da residência (Yadon et al., 2003). A presença do cão no domicílio, não determinou risco significativo para aquisição da doença (Evans et al.,1992). Entretanto, alguns estudos relatam que o risco do homem contrair a LV aumenta na presença de cães infectados ou não no peridomicílio (Gavgani et al., 2002; Borges et al., 2009; Faye et al., 2011). Pela importância dos cães na epidemiologia da LV, inúmeros estudos têm sido feitos na tentativa de conhecer os fatores que possam ter relevância nesse contexto. Aspectos como sexo, idade, raça, tipo de pelagem, função dos animais, entre outros, têm sido investigados. 11 Aspectos relacionados ao hábito do animal como função de guarda, habitar o peridomicílio foram descritos como fatores de risco para LVC, devido ao maior contato com o vetor. Cães de grande porte, pela maior área corporal, também foi um aspecto mencionado (Amora et al., 2006). Estudos demonstram não haver predisposição quanto ao sexo e faixa etária (Almeida et al., 2009; Oliveira et al., 2010). Raças, como Boxer, Cocker Spaniel, Rottweiler têm sido relatadas como mais susceptíveis para desenvolver a doença (França-Silva et al., 2003), enquanto a raça Ibizan Hound raramente desenvolve sinais clínicos de LVC (Solano- Gallego et al., 2000). Outros estudos não confirmaram predisposição racial para LVC (Almeida et al., 2009; Oliveira et al., 2010). Associado a isso, a proximidade das residências caninas com áreas de vegetação têm sido associado à infecção, justificado pelo maior contato ao vetor nesses ambientes (Rondon et al., 2008). Um dos fatores de risco observados mundialmente está associado ao processo migratório, vinculado à deterioração das condições sociais e econômicas. A expansão da doença no nordeste brasileiro coincidiu com a migração de pessoas e animais para a zona urbana em consequência da seca. Em outras regiões do Brasil, fenômenos como construção de rodovias, exploração mineral e agropecuária ou atividades militares tiveram grande associação (Antonialli et al., 2007). Estes dados demonstram que o controle da doença deve focar inúmeros aspectos na cadeia epidemiológica. 1.6. Tripanosomatídeos de ocorrência em cães domésticos O gênero Trypanosoma contém agentes causadores de inúmeras doenças de importância médica e veterinária, sendo foco de atenção nas ações de Saúde Pública (Eloy e Lucheis, 2009). Nesse contexto, o cão doméstico tem sido alvo de alguns estudos. Na epidemiologia da doença de Chagas os mamíferos domésticos (cães e gatos) e os peridomésticos (roedores e marsupiais) são responsáveis pela interação entre os ciclos 12 doméstico e silvestre de transmissão (Cardinal et al., 2008). Cães infectados reproduzem com fidelidade as fases aguda e crônica da doença que ocorre no homem (Andrade et al., 1997), sendo considerado um bom modelo experimental desta Tripanossomíase. Acredita-se que estes animais infectam-se do mesmo modo que o homem, através do contato direto com fezes e urina de triatomíneos, sendo também uma vítima no ciclo de transmissão. Segundo Estrada-Franco et al. (2006) cães domésticos representam fator de risco para doença de Chagas para o homem, associado ao estreito contato entre os mesmos, particularmente quando os cães são mantidos dentro da residência aumentando significativamente a transmissão. Devido a sua persistente parasitemia, esses animais têm uma maior capacidade de infectar os triatomíneos do que o homem e tem sido usado como eficiente sentinela para avaliar a reinfecção por T. cruzi na vigilância do vetor e infecção humana (Crisante et al., 2006). A importância canina na epidemiologia da doença de Chagas tem impulsionado estudos de soroprevalência nas áreas endêmicas (Campos-Valdez et al., 2001; Souza et al., 2009). Outra espécie, que no Brasil, aflige os proprietários de cães, é o T. evansi cuja presença de infecção canina é tida em algumas situações, como uma fonte de propagação deste protozoário (Franke et al, 1994; Savani et al., 2005; Franciscato et al., 2007). T. evansi é o agente da doença conhecida como “Mal das cadeiras” que causa considerável mortalidade entre equinos na região Centro-oeste do Brasil, resultando em significativa perda econômica. Alta morbidade e mortalidade são observadas em cães infectados com T. evansi. Franke et al. (1994) em estudo no pantanal matogrossense observou uma prevalência de 30% de cães infectados por T. evansi, sugerindo que seu contato com equinos pode fazer desses animais importantes reservatórios para o parasito na região. A transmissão deste agente é feito de modo mecânico por intermédio de dípteros hematófagos dos gêneros Stomoxys e Tabanus. 13 Nas Américas, outra espécie de tripanosoma frequentemente encontrado infectando homens, animais domésticos e silvestres é T. rangeli. Sua transmissão ocorre por triatomíneos principalmente do gênero Rhodnius. Embora esse agente não cause doença para o hospedeiro vertebrado, sua importância se deve ao compartilhamento de reservatórios e vetores comuns ao T. cruzi, dificultando o diagnóstico diferencial na infecção (Ramirez et al, 2002). A infecção em cães por T. rangeli já foi descrita em mais de uma ocasião (Pifano et al., 1948; D` Alessandro, 1976; Dantas-Torres, 2008). Recentemente, no município do Rio de Janeiro, foi descrita uma nova espécie do gênero Trypanosoma, identificado como Trypanosoma caninum (Madeira et al., 2009a), infectando um cão doméstico. Posteriormente a este relato, outras amostras desse parasito foram encontrados em outras áreas do município do Rio de Janeiro (Pinto et al., 2010; Silva et al., 2011) e em outras regiões como Belo Horizonte, Bauru e Brasília (Barros et al., 2012). Em todas as ocasiões, esse parasito foi isolado em cultivo axênico durante estudo envolvendo as leishmanioses caninas. Apesar de atualmente já se ter o relato de 53 amostras de T. caninum (Barros et al., 2012), pouco se sabe sobre a biologia e epidemiologia desse parasito, embora algumas informações já possam ser consideradas: a) T. caninum é facilmente isolado em meio de cultura axênica apresentando todas as formas evolutivas características do gênero Trypanosoma (Hoare, 1972). No cultivo em meio de cultura bifásico (NNN + meio Schneider) formas epimastigotas são predominantes, mas formas tripomastigotas, esferomastigotas e formas em fases de transição são também observadas. A manutenção desse parasito em meio de cultura foi um passo inicial e constitui condição crucial para o seu estudo (Madeira et al., 2009a); b) T. caninum não é capaz de infectar experimentalmente triatomíneos dos gêneros Rhodnius e Triatoma. Esse dado sugere que talvez outros artrópodes possam estar atuando como vetores, como é observado no ciclo de outras 14 espécies de tripanosomas, sendo importante que possíveis vetores, como mosquitos, flebotomíneos, carrapatos e pulgas sejam investigados (Madeira et al., 2009a). Em áreas endêmicas de LV, já houve a suspeita da participação de carrapatos no ciclo de transmissão de L. chagasi entre cães domésticos (Coutinho et al., 2005; Solano-Gallego et al., 2012) e c) outro aspecto importante está relacionado à morfologia desse parasito. T. caninum pode ser facilmente distinguido de outros tripanosomas que ocorrem em mamíferos, pelo tamanho do comprimento total do corpo e do cinetoplasto de formas tripomastigotas, embora a heterogeneidade morfológica descrita para os representantes do gênero Trypanosoma restrinja este parâmetro para classificação ou identificação (Madeira et al., 2009a). Inúmeros aspectos biológicos ainda precisam ser conhecidos sobre essa nova espécie. Entretanto, um aspecto interessante é o sítio anatômico de onde tem sido isolado, apresentando uma característica incomum e inédita para os representantes do gênero Trypanosoma, relatado em vários estudos. Até o momento, todos os isolados foram obtidos a partir do cultivo da pele íntegra de cães aparentemente saudáveis. Outro dado importante, refere-se a patogenicidade desse parasito para os cães. Aparentemente, T. caninum parece não ser patogênico para o cão, tendo sido isolado, na maioria das vezes, de cães saudáveis (Madeira et al., 2009a). No entanto, apesar dessa característica, esse parasito pode estimular o sistema imune humoral do cão, induzindo a produção de anticorpos que podem reagir especificamente e de forma cruzada com outros tripanosomatídeos, principalmente com Leishmania, para o qual os cães domésticos são rotineiramente monitorados (Alves et al., 2012). Dessa forma, a presença de T. caninum em diferentes regiões brasileiras sugere a existência de um ciclo natural desse protozoário entre cães domésticos. Esse fato é de grande importância já que T. caninum tem sido encontrado em áreas endêmicas de LV. 15 Ainda não se conhece os possíveis vetores, assim como são escassas as informações epidemiológicas desse parasito. Considerando a importância desse conhecimento, estudos devem ser incentivados, visando esclarecer aspectos relacionados ao ciclo epidemiológico, diagnóstico e à prevalência. Embora T. caninum pareça não causar qualquer alteração clínica ou dermatológica nos cães infectados, a compreensão de como este parasito está sendo mantido e transmitido sob condições naturais é fundamental, principalmente em áreas onde as leishmanioses caninas ocorrem. 16 2. JUSTIFICATIVA Nos últimos anos, no estado de Mato Grosso, vem-se registrando um aumento do número de casos humanos de leishmaniose, tanto da forma tegumentar quanto visceral da doença. O estado atualmente está classificado em terceiro lugar em número de notificações da forma tegumentar no Brasil e, recentemente, surtos da forma visceral foram diagnosticados em várias cidades do estado, inclusive com casos de óbitos (MS, 2012a; MS, 2012b). Sabendo-se da importância dos cães domésticos na cadeia de transmissão da LV e da carência de informações sobre a doença canina em diferentes municípios desse estado, torna-se importante pesquisar a distribuição e prevalência da infecção canina na cidade de Cuiabá, município considerado prioritário pela Secretaria Estadual de Saúde de Mato Grosso, no que concerne à doença. Deve-se considerar que as leishmanioses estão em expansão em diversas regiões brasileiras e, assim, esforços devem ser empregados para conter a sua propagação (MS, 2006; Marzochi et al., 2009). Neste contexto, o diagnóstico acurado é uma questão a ser solucionada, contribuindo para a identificação inequívoca dos casos de infecção por L. chagasi em tempo hábil. Ainda nesse contexto, a descrição de outros tripanosomatídeos em áreas de sobreposição com a LV, como L. braziliensis, Trypanosoma caninum, espécie recentemente descrita, e T. cruzi pode ter implicações para o controle desta doença na medida em que as ações de controle incluem a eutanásia de cães soropositivos (Silva et al., 2011). Adicionalmente, identificação das espécies de Leishmania circulantes em cães domésticos, assim como o estabelecimento de possíveis fatores de risco é de fundamental importância (Souza et al., 2009a). Todo o conhecimento gerado é essencial para o estabelecimento de medidas de controle apropriadas, bem como, importantes para nortear estudos epidemiológicos que possam contribuir para o controle da doença. Neste sentido, a 17 contribuição deste trabalho se faz pelo conhecimento de aspectos que envolvem não só a leishmaniose canina em Cuiabá, mas também na identificação de mais um agente complicador do diagnóstico sorológico da infecção por L. chagasi em cães. Este estudo foi desenvolvido em parceria entre o Laboratório de Leishmanioses do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT), o Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos (LAPCLIN- DERMZOO) e o Laboratório de Vigilância em Leishmanioses (VigiLeish), ambos do IPEC/FIOCRUZ, que contam com equipe experiente no estudo dessa enfermidade promovendo intercâmbio válido no que concerne ao desenvolvimento da pesquisa no estado de Mato Grosso. 18 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Avaliar a ocorrência da infecção por L. chagasi e outros tripanosomatídeos em cães domésticos no município de Cuiabá, Mato Grosso. 3.2. Objetivos Específicos 1. Avaliar a cultura como ferramenta diagnóstica da leishmaniose visceral canina e outros tripanosomatídeos, investigando diferentes espécimes clínicos; 2. Caracterizar as amostras de Leishmania ou outros tripanosomatídeos isolados em meio de cultura, empregando a técnica de eletroforese de enzimas e PCR; 3. Estimar a soroprevalência através da imunofluorescência indireta e identificar os fatores de risco associados com a infecção canina por Leishmania; 4. Avaliar a PCR como ferramenta diagnóstica da leishmaniose visceral canina, investigando diferentes amostras biológicas dos cães incluídos no estudo; 5. Descrever aspectos clínicos de cães infectados por Leishmania chagasi e outros tripanosomatídeos correlacionando com dados laboratoriais; 19 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Desenho do estudo e população alvo Este estudo consistiu na investigação diagnóstica de cães domiciliados na cidade de Cuiabá, através da realização de inquérito canino, por visitas domiciliares, considerando o último domicilio a cada cinco contados. A amostragem canina foi definida pelo programa Epi info 3.3.2 (CDC, Atlanta, EUA) e considerou cães de ambos os sexos e idade igual ou superior a seis meses, provenientes de áreas onde casos humanos e caninos de LV foram relatados. O tamanho amostral foi de 430 animais e foi calculado considerando a soroprevalência para LVC de 8,4%, obtida em estudo realizado em Cuiabá (Mestre e Fontes, 2007), com intervalo de confiança de 99% e erro aceitável de 2%, com população baseada no censo canino realizado no ano de 2007. Em algumas etapas do estudo, foram incluídos cães atendidos na rotina clínica do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET). 4.2. Área de Estudo O município de Cuiabá está localizado pelas coordenadas 15º35’56.10’’S e 56º05’41.62’’ e possui extensão territorial de 3.538 km² com altitude de 165 metros acima do nível do mar, com vegetação predominante constituída de cerrado. Apresenta clima tropical quente e sub-úmido com precipitação média anual de 1750 mm, cuja temperatura máxima, nos meses mais quentes, fica em torno de 43°C e a mínima varia entre 12 e 14ºC. Possui uma população de 526.830 habitantes (IBGE, 2009). O inquérito canino foi realizado nos bairros Barreiro Branco (68 cães de 150) e Coxipó do Ouro (53 cães de 92), localizados em área rural e regional Norte e nos bairros Osmar Cabral (107 cães de 770), Bela Vista (110 cães de 939) e Jardim União (92 cães de 344), na urbana e regionais, Sul, Leste e 20 Norte, respectivamente, na cidade de Cuiabá (Fig. 1). Os casos atendidos no HOVET foram oriundos de Cuiabá e de municípios vizinhos, sendo incluídos no estudo 52 cães. Figura 1: Localização espacial dos bairros pesquisados para a ocorrência de leishmaniose visceral canina na cidade de Cuiabá, Mato Grosso. 4.3. Animais e coleta de amostras Após autorização dos proprietários, os cães foram contidos mecanicamente amordaçados para exame físico e coleta de amostras biológicas. O exame físico considerou sinais clínicos relacionados a LVC, de forma que os animais pudessem ser agrupados como assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos, segundo a classificação proposta por Mancianti et al. (1988), sendo todas as informações registradas em uma ficha (Anexo 2). Todos os animais foram avaliados num único momento, e durante o estudo os animais encontrados naturalmente infectados por Trypanosoma caninum foram reavaliados em intervalos de 3, 6 e 12 meses. Para a coleta de amostras biológicas, animais foram sedados com cloridrato de quetamina (10 mg/kg) associado a acepromazina (0,2 mg/kg) por via 21 intramuscular. De todos os animais, incluindo os atendidos no HOVET, foram coletadas as seguintes amostras biológicas: a) Sangue: coletou-se cerca de 10mL de sangue por punção cefálica ou jugular, que foi distribuído para dois tubos, um contendo anticoagulante para cultura e testes moleculares e outro, sem anticoagulante para testes sorológicos. Esse material foi transportado sob refrigeração e, por centrifugação o soro foi separado e conservado a - 20ºC até o momento da realização dos testes sorológicos. Para cultura, cerca de 0.2-0.4mL foi semeado e o restante do material foi centrifugado a 10.000 rpm para separação da camada leucocitária, utilizada nos testes moleculares. b) Biopsias teciduais: foram coletados fragmentos de pele integra da região escapular e úlceras cutâneas quando presentes. Para isso, foi realizada tricotomia, anti-sepsia e anestesia local com lidocaína a 2%. Após, foram coletados três fragmentos de pele íntegra utilizando punch de 3mm que posteriormente foram processados para exames parasitológicos (cultura) e moleculares. Das lesões, foram coletados três fragmentos para os mesmos exames. c) Punções: em todos os animais foi realizado o aspirado ganglionar, obtido dos linfonodos poplíteos, utilizando seringa de 20ml com agulha 30x8mm, com o auxílio do citoaspirador de Valeri. Realizou-se também, aspirado de medula óssea (MO), obtido do manúbrio do esterno, utilizando seringa de 20ml com agulha 40x12mm, após tricotomia, assepsia e anestesia local com lidocaína 2%. A MO foi processada para cultura e para ensaios moleculares e o material puncionado do linfonodo foi reservado somente para testes moleculares. 22 4.4. Ensaios empregados no estudo 4.4.1. Testes sorológicos Todos os animais foram avaliados quanto à reatividade sorológica para antígenos de Leishmania sp. através dos ensaios de imunofluorescência indireta (IFI), utilizando o kit (IFI-leishmaniose visceral canina) produzido por Bio-Manguinhos (FIOCRUZ/MS). Os animais que foram encontrados infectados por Trypanosoma caninum, além da IFI, foram avaliados pelos testes ELISA (EIE-leishmaniose visceral canina) e pelo teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma (Dual Path Platform - DPPTM). Esses animais, também foram avaliados pelos testes de IFI e ELISA, empregando antígenos homólogos para o diagnóstico de T. caninum (Alves et al., 2012). 4.4.2. Isolamento parasitário em meio de cultura Foram processados para cultura, sangue, MO e fragmentos teciduais (pele e úlceras). Os fragmentos de pele e úlceras, logo após a biopsia, foram mergulhados em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 acrescido de antibióticos (penicilina e estreptomicina) e antifungico (fluorocitocina) e conservados a temperatura de 4ºC por 24 horas. Após, as amostras foram semeadas em meio bifásico NNN (Novy, MacNeal, Nicole) contendo como fase líquida o meio Schneider’s (Drosophila medium - Sigma), acrescido de 10% de soro fetal bovino. O sangue periférico e MO, coletados em tubos contendo anticoagulante, foram semeados diretamente no meio de cultura (cerca de 0.2-0.4mL). As culturas foram feitas em duplicatas e conservadas em estufa biológica a 26-28ºC e examinadas semanalmente durante 40-50 dias por exames a fresco buscando evidenciar formas flageladas. Nos casos onde ocorreu isolamento parasitário, as amostras foram expandidas para produção de massa parasitária para posterior caracterização etiológica. 23 4.4.3. Exame citológico Para este exame, foram processadas amostras de sangue, MO e aspirado de linfonodo, coletados do grupo de animais infectados por T. caninum. As lâminas foram confeccionadas no momento da coleta e posteriormente submetidas à fixação com álcool metílico P.A. durante cinco minutos e coloração pelo Giemsa. Após, as lâminas foram examinadas em microscópio óptico para pesquisa de formas parasitárias, percorrendo, no mínimo cerca de 200 campos utilizando objetiva de imersão (x 1000). 4.4.4. Testes moleculares Utilizou-se diferentes ensaios pela reação em cadeia da polimerase (PCR), que variou de acordo com o objetivo do estudo. Foram processadas amostras de sangue (capa leucocitária), pele íntegra, úlceras cutâneas, MO e aspirado de linfonodo. A extração de DNA das diferentes amostras clínicas foi realizada pelo método fenol/clorofórmio de acordo com protocolo descritos por Gomes et al. (2007). Sucintamente, as amostras foram colocadas em tampão de lise contendo 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10mM EDTA; 0.5% SDS; 0.01% N-laurilsarcozyl e 100 μg/ml de proteinase K e submetidos à agitação em vortex e posteriormente incubados a 56ºC até completa lise celular. Os aspirados MO, linfonodo e capa leucocitária permaneceram nessa condição por cerca de 30- 120 minutos e os fragmentos de tecido (pele e úlcera), por cerca de 5-24 horas. Após, realizou-se lavagem com etanol 70% por 10 minutos a 10,000 x g e o precipitado de DNA foi dissolvido em água ultra pura contendo 20μg/ml de RNAase e estocado a –20ºC até a realização da PCR. Para as amostras isoladas em cultura, utilizou-se o processo de extração com DNAzol (Barros et al, 2012). 24 Para os ensaios de PCR, utilizaram-se os iniciadores descritos abaixo, considerando os protocolos descritos nas respectivas referências. Tabela 1: Especificação dos alvos moleculares que foram utilizados neste estudo Alvo do DNA Iniciadores Sequência do alvo 5’- 3’ Referência 18S rDNA TRY927F GAAACAAGAAACACGGGAG Smith et al. (2008) TRY927R CTACTGGGCAGCTTGGA SSU561F TGGGATAACAAAGGAGCA SSU561R CTGAGACTGTAACCTCAAAGC kDNA 150 (C/G)(C/G)(C/G)(A/T)CTAT(A/T)TTACACC AACCCC Degrave et al. (1994) 152 GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA  -globina CAACTTCATCCACGTTCACC Quaresma et al. (2009) ACACAACTGTGTTCACTAGC kDNA RV1 CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG G Lachaud et al. (2002) RV2 CCA CCT GGC TAT TTT ACA CCA 4.4.5. Sequenciamento molecular O sequenciamento molecular foi realizado com os produtos amplificados para os alvos do gene ribossomal (18S rDNA) das amostras de T. caninum isoladas no estudo. Após a amplificação, os produtos do segundo “round” foram purificados com kit Quiackiq (Qiagen) seguindo orientações do fabricante. As sequência de nucleotídeos foram então determinadas em sequenciador automático (3730 DNA Analyzer, Applied Biosystems) e analisadas com o programa Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg) e MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007). As sequências obtidas foram depositadas no GenBank e alinhadas entre si e com sequências de diferentes espécies de tripanosomatídeos recuperada no GenBank. 25 4.4.6. Eletroforese de enzimas (MLEE) Todos os isolados obtidos em meio de cultura (formas promastigotas) foram identificados por eletroforese de enzimas (isoenzimas). Inicialmente foi feita a expansão parasitária para obtenção de cerca de 109 parasitos que posteriormente foi submetida a lavagens em tampão próprio, sob centrifugação até a obtenção de um sedimento que foi colocado em nitrogênio líquido (N2) até a realização das corridas eletroforéticas. Foram empregados cinco sistemas enzimáticos: 6PGDH; GPI; NH (dois loci) e G6PDH baseados nos protocolos de Cupolillo et al. (1994). Amostras de referência de Leishmania braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) e L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) foram empregadas em todas as corridas eletroforéticas. Para a corrida eletroforética, foi preparado um gel de agarose 1% (Tipo V) em tampão de acordo com o sistema enzimático utilizado, que depois de dissolvida e fundida foi colocada sobre um filme de poliestireno onde a amostra teste foi aplicada. A corrida eletroforética foi feita empregando-se uma cuba de eletroforese horizontal devidamente acoplada a um banho maria com circulação para manter a refrigeração em torno de 4ºC. A revelação da atividade enzimática das amostras foi feita colocando-se diretamente sobre o gel uma mistura contendo os substratos, transportadores e receptores de elétrons, cofatores e tampões próprios para cada enzima, baseados em protocolos já descritos na literatura. A reação foi interrompida adicionando-se ácido acético a 5% e a mobilidade eletroforética dos isolados foi comparada com o padrão das amostras de referência. Na figura 2 apresentamos um esquema, resumindo as etapas que envolveram a captação dos animais estudados, as diferentes amostras biológicas analisadas, assim como os métodos laboratoriais empregados para o diagnóstico e identificação dos parasitas isolados. 26 * refere-se a dois ensaios realizados Figura 2. Fluxograma apresentando as etapas do estudo, identificando as amostras biológicas coletadas dos animais e os ensaios laboratoriais empregados nas análises. 4.5. Análise epidemiológica e variáveis estudadas Para descrever as características gerais da população canina e do ambiente de moradia, foram coletadas informações, junto ao proprietário do animal, que foram incluídas na ficha individual, preenchida no momento da visita (Anexo 2). Tais informações foram utilizadas para análise dos fatores de risco associados à infecção canina para leishmaniose, utilizando dados sorológicos (IFI). Inquérito Avaliação clínica e coleta de amostras biológicas HOVET Sangue Pele Úlceras Med. Óssea Linfonodo cultura PCR cultura PCR cultura citologia PCR citologia PCR sorologia cultura citologia PCR IFI* DPP ELISA* 18S rDNA kDNA* β-globina 18S rDNA kDNA* β-globina ) 18S rDNA kDNA* β-globina 18S rDNA kDNA* β-globina 27 Com relação ao ambiente, foram consideradas as seguintes variáveis: proximidade com áreas de vegetação (< 100m ou > 100m); presença de outros animais domésticos (sim, não); presença de árvores e criações de animais no quintal (sim, não); coleta pública de lixo (sim, não). Com relação aos animais, consideramos para as análises: raça (com raça definida – CRD e sem raça definida – SRD); sexo (macho ou fêmea); idade (< 1 ano, 1-3 anos, 3-6 anos, >6 anos ou indeterminada); função do animal na casa (função de guarda, caça ou companhia); habitat do animal (limitado ao domicílio, ao peridomicílio ou possuir livre acesso a rua). Consideramos ainda, o conhecimento dos proprietários com relação à doença e às medidas de controle e, a ocorrência de casos caninos e humanos da doença no entorno das áreas estudadas. 4.6. Análise dos resultados Todos os dados clínicos e demográficos dos animais, aspectos do ambiente e resultados obtidos com as diferentes amostras biológicas e testes laboratoriais, foram transferidos para um banco de dados e analisados de acordo com o objeto das publicações. Utilizou-se o programa estatístico EpiInfo 3.3.2 (CDC, Atlanta, EUA). Para análise dos fatores de risco, associados à infecção por Leishmania, inicialmente consideramos a frequência dos eventos selecionados e posteriormente, foram realizados cruzamentos das variáveis independentes com a dependente (sorologia), determinando-se a “odds ratio”, com intervalo de confiança de 95%. A significância estatística das associações foi calculada através do teste qui-quadrado ou exato de Fisher’s. Com relação aos dados laboratoriais, foi calculada a frequência dos resultados positivos, considerando a amostra biológica analisada. Para comparações dos resultados da PCR (específica para Leishmania) e o status clínico dos animais foi utilizado teste do qui- quadrado. Avaliamos, também, a concordância entre a PCR e o resultado da cultura, através do Kappa (k), empregando a classificação proposta por Shrout (1998). 28 4.7. Procedimento Ético O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA- FIOCRUZ), sob o nº 52/2009-3, licença LW-01/10 (Anexo 1). No momento da visita domiciliar, foi solicitada ao proprietário a assinatura de um termo de consentimento para a realização dos procedimentos nos animais. 29 5. RESULTADOS Os resultados obtidos neste estudo serão apresentados no formato de artigos publicados ou em fase de publicação. Nesta seção estão anexados seis artigos ordenados da seguinte forma:  Artigo 1: Apresenta e discute a cultura parasitológica como ferramenta diagnóstica da leishmaniose visceral canina, realizada em diferentes amostras clínicas de 482 cães.  Artigo 2: Apresenta a caracterização dos casos de Trypanosoma caninum descritos em diferentes regiões do Brasil, incluindo os casos detectados em Cuiabá.  Artigo 3: Refere-se ao estudo dos fatores de risco associados com a infecção canina por Leishmania nas áreas estudadas.  Artigo 4: Apresenta e discute a utilização da PCR como uma ferramenta de rastreamento de Leishmania chagasi, empregando diferentes amostras biológicas coletadas dos cães estudados.  Artigo 5: Descreve aspectos clínicos e laboratoriais de 14 casos da infecção por Trypanosoma caninum detectados durante a realização deste estudo.  Artigo 6: Relato de caso, visando descrever o encontro, pela primeira vez, da infecção aguda por Trypanosoma cruzi em um cão na cidade de Cuiabá 30 5.1 - Artigo 1 __________________________________________________________________________ Use of parasitological culture to detect Leishmania (Leishmania) chagasi in naturally infected dogs Publicado na revista Vector Borne Zoonotic Disease, 11: 1555-60, 2011 ___________________________________________________________________________ A leishmaniose visceral (LV) é uma doença em expansão no Brasil, mesmo assim, lacunas relacionadas ao conhecimento das espécies circulantes nas áreas endêmicas ainda persistem. No estado de Mato Grosso, região onde o estudo foi realizado, LV tem sido relatada em cerca de 34 municípios, no entanto, pouco se sabe sobre aspectos da infecção canina e das espécies de Leishmania que circulam nesses animais na cidade de Cuiabá. Este estudo objetivou o emprego da cultura parasitológica como ferramenta diagnóstica e rastreamento das espécies de Leishmania e de outros tripanosomatídeos na população canina oriundos de regiões onde ocorrem casos de LV. Quatrocentos e oitenta e dois cães foram incluídos no estudo, dos quais, a partir do cultivo de diferentes amostras clínicas, obteve-se isolamento parasitário de 54 animais. Leishmania chagasi foi isolada de 40 cães e Trypanosoma caninum de 14. Os resultados obtidos neste estudo enfatizam o valor da cultura para o diagnóstico da leishmaniose canina e comprovam a circulação de L. chagasi, assim como de T. caninum, em diferentes bairros da cidade de Cuiabá, sendo os primeiros relatos da ocorrência de ambos os agentes. Este artigo responde o objetivo específico nº 1 e parcialmente aos objetivos específicos nº 2 e nº 5 desta tese. 31 32 33 34 35 36 37 5.2 - Artigo 2 _________________________________________________________________________ Occurrence of Trypanosoma caninum in areas overlapping with leishmaniasis in Brazil: what is the real impact of canine leishmaniasis control? Publicado na revista Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 106: 419-23, 2012 ___________________________________________________________________________ Trypanosoma caninum é um parasito do gênero Trypanosoma recentemente descrito infectando cães. Inicialmente, esse parasito foi descrito no município do Rio de Janeiro e posteriormente em outras regiões do Brasil, levantando a suspeita de um ciclo natural desse protozoário entre cães domésticos. Aspectos biológicos desse parasito, assim como dados epidemiológicos ainda são escassos. A descrição de um novo tripanosomatídeo em áreas endêmicas de leishmaniose visceral pode abrir discussões, relacionadas principalmente ao diagnóstico e eutanásia de cães, baseado somente em evidências sorológicas. A reatividade sorológica cruzada entre membros da família Trypanosomatidae é um fato que constitui um dos maiores problemas em áreas onde ocorre a sobreposição de diferentes agentes etiológicos. Considerando a importância que o cão doméstico possui no ciclo de transmissão da leishmaniose visceral, é importante que aspectos desse parasita sejam conhecidos. Este artigo trata da identificação taxonômica de 33 amostras de Trypanosoma caninum isoladas de cães habitando diferentes regiões brasileiras, entre eles 14 casos descritos em Cuiabá, identificados durante o estudo principal. Neste artigo, além da identificação parasitária, discute-se sobre a possibilidade desse fenômeno interferir nas ações de controle da leishmaniose visceral no Brasil. Este artigo responde ao objetivo nº 2 desta tese 38 39 40 41 42 43 5.3 - Artigo 3 __________________________________________________________________________ Canine Visceral Leishmaniasis: Seroprevalence and risk factors in Cuiabá, Mato Grosso, Brazil Artigo aceito para publicação na revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 2012 __________________________________________________________________________ Nas diversas regiões onde leishmaniose visceral ocorre, são observadas possíveis interações entre os diferentes elos da cadeia epidemiológica. Fatores de risco associados a doença humana e/ou canina têm sido pesquisados, visando obter elementos que possam ser empregados no controle desse agravo. Como já dito anteriormente, em Cuiabá, pouco se conhece sobre aspectos da leishmaniose visceral canina. Assim, este artigo visou estimar a soroprevalência da infecção canina e conhecer possíveis fatores de risco a ela associados na cidade de Cuiabá. Quatrocentos e trinta (430) cães foram avaliados através da técnica de imunofluorescência indireta e, variáveis relacionadas aos animais, ambiente e ao conhecimento dos proprietários sobre a LV foram considerados para as análises. Os resultados demonstraram uma soroprevalência de 22,1% no grupo estudado, revelando que os animais residentes em ambiente rural possuem um risco maior de adquirir a infecção. Também foi visto que fatores relacionados aos hábitos dos animais, como livre acesso a rua e função de guarda foram indicativos preditores da infecção por Leishmania. Cuiabá é uma região que possui características propícias à instalação da leishmaniose visceral de forma endêmica e, este estudo contribuiu para o conhecimento de aspectos da doença e aponta a necessidade da inclusão de ações educacionais na rotina de controle nessa cidade. Este artigo responde ao objetivo específico nº 3 desta tese. 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 5.4 - Artigo 4 __________________________________________________________________________ Canine visceral leishmaniasis diagnosis: assessment of PCR in different biological samples Artigo submetido para publicação na revista Research in Veterinary Science ___________________________________________________________________________ O diagnóstico acurado da LVC ainda é um desafio, já que é uma doença de grande espectro clínico. Embora testes sorológicos sejam os mais aplicados para o diagnóstico, a pesquisa de ferramentas que apresentem maior sensibilidade e especificidade tem sido constantemente buscados. Nesse contexto, métodos moleculares, como a PCR, têm surgido como uma excelente alternativa, no entanto, não existe um consenso da melhor amostra biológica que possa ser utilizada nesse ensaio. Este artigo divulga o resultado de 430 cães avaliados através da PCR, a partir da utilização de amostras como capa leucocitária, medula óssea, fragmentos de pele e úlceras cutâneas e punção de linfonodo, correlacionando os resultados laboratoriais obtidos com o status clínico dos cães. DNA de Leishmania sp. foi detectado em 14,6% cães (n=63), independente da amostra analisada, contemplando casos sintomáticos (n=13), oligossintomáticos (n=23) e assintomáticos (n=27). Todas essas amostras foram identificadas como L. chagasi, num segundo ensaio de PCR específico para o complexo L. donovani. A amostra de linfonodo (41; 9.6%) foi o sítio que apresentou maior frequência de positividade, seguido da pele (27; 6.3%), medula óssea (26; 6.1%) e capa leucocitária (20; 4.6%). Úlceras cutâneas foram positivas em 13 (59,1%) de 22 casos. Adicionalmente, os animais sintomáticos, foram mais facilmente diagnosticados ao utilizarmos amostras de linfonodo, medula óssea e pele em relação ao grupo de cães assintomáticos. Concluindo, a técnica de PCR mostrou-se de grande utilidade na detecção de DNA de L. chagasi, especialmente em amostra de linfonodo, independente do status clínico do cão. Esse 62 resultado, associado ao fato de ter sido uma amostra facilmente coletada dos cães, aponta este sítio como uma alternativa para utilização em inquéritos epidemiológicos através da PCR. Úlcera cutânea, quando presente, também representa bom alvo na detecção de LVC. Este artigo responde o objetivo específico nº 4 desta tese. 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 5.5. Artigo 5 __________________________________________________________________________ Natural infection by Trypanosoma caninum, a new parasite isolated from dogs: study of 14 cases occurred on Cuiaba, Brazil Artigo submetido para publicação na revista Veterinary Parasitology ___________________________________________________________________________ Trypanosoma caninum constitui a mais recente espécie de tripanosomatídeo descrita no Brasil, que tem sido encontrada na infecção natural de cães domésticos. Muito pouco ainda se conhece sobre esse parasito e neste artigo são descritos aspectos clínicos e laboratoriais de 14 cães naturalmente infectados por esse parasito, diagnosticados em Cuiabá durante a realização desta tese. Os animais foram avaliados clinicamente e monitorados em intervalos que variaram de 3 a 12 meses quanto a presença do parasito e/ou DNA em diferentes amostras biológicas através de métodos parasitológicos (cultura e exame direto) e moleculares (PCR). Além disso, anticorpos específicos anti-T. caninum e anti-Leishmania foram investigados nesses animais. Os resultados revelaram que dos 14 animais estudados, 10 encontravam-se em bom estado geral e tal status clínico não variou durante o monitoramento. Anticorpos anti-T. caninum foram confirmados em 10 animais e a co- infecção por L. chagasi foi comprovada em dois cães. O estudo confirma uma característica biológica particular deste parasito, como já apontado em outros estudos e sugere baixa patogenicidade para os cães. Os resultados apresentados neste artigo comprovam a sobreposição de áreas endêmicas em Cuiabá e contribuem para o conhecimento de aspectos desse novo parasito descrito no Brasil, os quais podem ser úteis em ações de controle que envolve a leishmaniose visceral. Este artigo responde o objetivo específico nº 5 desta tese. 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 5.6. Artigo 6 __________________________________________________________________________ Natural infection by Trypanosoma cruzi in one dog in Central Western Brazil – a Case Report Artigo submetido para publicação na Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. __________________________________________________________________________ O gênero Trypanosoma contém agentes causadores de inúmeras doenças de importância médica e veterinária, entre eles o Trypanosoma cruzi, causando a doença de Chagas, como é conhecida popularmente. Os cães são considerados importantes reservatórios nas áreas endêmicas, representando fator de risco para a população humana. Este relato descreve um caso de doença de Chagas em um cão, ocorrido na cidade de Cuiabá detectado durante a realização desta tese. O animal foi atendido no Hospital Veterinário da UFMT, com histórico de paresia dos membros posteriores com progressão para tetraparesia em cerca de três dias, além de suspeita de gestação. O diagnóstico foi feito a partir de exame citológico em esfregaço sanguíneo, onde formas flageladas tripomastigotas foram encontradas. Adicionalmente, a PCR específica e sequenciamento molecular, confirmou a etiologia do parasito. O animal progrediu para o óbito apesar de ter sido instituído tratamento com diaceturato de diminazeno, que embora não seja utilizada na doença de Chagas, vem sendo empregada na infecção por T. evansi com bons resultados. Em Cuiabá, não existe registro da doença de Chagas aguda, sendo este o primeiro relato da doença em cães nessa região, constituindo um alerta aos profissionais da saúde e autoridades sanitárias para a possibilidade da transmissão desta zoonose. Este artigo está relacionado ao objetivo específico nº 5 desta tese. 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 6. DISCUSSÃO GERAL Cães domésticos são considerados importantes reservatórios da L. chagasi, agente causador da leishmaniose visceral humana e canina. Por essa razão, são alvos de atenção por parte dos órgãos responsáveis pelo controle (MS, 2006). Na cidade de Cuiabá, estado de Mato Grosso, embora sejam descritos casos humanos de LV, informações precisas sobre a doença nos cães domésticos ainda são escassas. Dessa forma, este estudo se propôs avaliar por diferentes parâmetros, cães domiciliados de cinco bairros em Cuiabá, contribuindo assim, com informações para o conhecimento desse agravo, nas áreas onde casos humanos e caninos são descritos. A cidade de Cuiabá é classificada como uma área de transmissão moderada para LV (MS, 2006). Até o ano de 2011 foram notificados 22 casos humanos (CCZ, 2012). Apesar de medidas de controle já serem desenvolvidas em algumas áreas dessa cidade, o conhecimento de aspectos epidemiológicos limitam-se aos vetores e à soroprevalência canina (Moura et al., 1999; Almeida et al., 2009; Almeida et al., 2010; Mestre et al., 2011). O conhecimento das espécies de Leishmania circulantes na população humana e canina é de suma importância para que estratégias de controle adequadas ao contexto epidemiológico da região sejam desenvolvidas. Até a realização deste estudo ainda não havia sido feito o isolamento e caracterização do agente causador da LV em Cuiabá, e o nosso estudo comprovou, pela primeira vez a circulação de L. chagasi nessa região. Dos 430 cães avaliados durante o inquérito por busca ativa, L. chagasi foi isolada de 2,8% (n=12) cães. Adicionalmente, dos 52 cães atendidos por demanda espontânea durante atendimento realizado no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT), em 28 (53,8%) houve isolamento do agente. Apesar da cultura parasitológica ser considerada padrão ouro para o diagnóstico das leishmanioses, a tentativa de isolamento parasitário em cães sororeatores não é feito na 117 rotina investigatória dos casos de LVC, devido ao grande volume de trabalho que é gerado com esta atividade. Entretanto, o isolamento e identificação etiológica são fundamentais, principalmente em áreas consideradas indenes para LV, como foi o caso recentemente descrito no estado do Rio Grande do Sul (Souza et al., 2009a) e Santa Catarina (Figueiredo et al., 2012) para que ações específicas, relacionadas ao controle, sejam implementadas (MS, 2006). Neste estudo, realizamos o cultivo de diferentes amostras biológicas dos cães e, obtivemos a comprovação da presença de L. chagasi em animais das cinco regiões estudadas. A técnica de isoenzimas empregada neste estudo, também se mostrou importante para a identificação etiológica dos isolados de Leishmania obtidos dos animais estudados. Adicionalmente, o isolamento de L. chagasi em cães oriundos do atendimento clínico do HOVET-UFMT, possibilitou verificar a dispersão do parasito pelo município de Cuiabá e também em municípios vizinhos à capital. Um dado interessante foi constatar que a pele íntegra apresentou-se numericamente superior para o isolamento parasitário em relação aos demais sítios pesquisados, principalmente nos casos sintomáticos. Alguns autores já apontam a pele como importante sítio para detecção de Leishmania (Lima et al., 2010; Queiroz et al., 2011). Em estudo conduzido por Madeira et al. (2009), onde 394 cães sororeatores para leishmaniose foram avaliados, L. chagasi foi isolada da pele de 78% dos animais estudados. Neste estudo, dos cães com isolamento de L. chagasi, 70% tiveram o parasito detectado na pele, reforçando esse sítio como um bom alvo na investigação parasitológica na LVC. Os resultados envolvendo a cultura parasitológica como ferramenta diagnóstica da LVC estão apresentados no artigo nº 1 desta tese. Outro dado constatado neste estudo está relacionado à condição clínica dos cães estudados. Observamos que os cães assintomáticos estão em maior prevalência como já descrito em outras regiões do Brasil (Dantas-Torres et al., 2006) e que os sinais mais 118 relevantes encontrados nos cães infectados em Cuiabá estão de acordo com o preconizado na literatura (Alvar et al., 2004; Reis et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2009). Entretanto, tal aspecto não foi importante para o diagnóstico da LVC. Já com relação à idade do cão e a infecção por Leishmania, encontramos uma correlação alta e positiva (r=1). O longo período de incubação na LVC tem sido associado a predisposição dos cães adultos em desenvolverem a doença (Arias et al., 1996), fato que poderia explicar a alta correlação encontrada neste estudo. Uma das medidas de controle da LV preconizadas no Brasil inclui a realização de inquérito sorológico canino e posterior eutanásia de cães sororeatores. Tal medida, embora aplicada nas áreas endêmicas, tem sido motivo de questionamentos, principalmente por não conseguir conter o avanço da doença (Costa, 2011). Outra questão que deve ser abordada, nesse contexto, é a possibilidade de ocorrer reações cruzadas nos testes sorológicos devido a presença de outros tripanosomatídeos nas áreas endêmicas (Alves et al., 2012). Em nosso estudo, comprovamos a presença de diferentes agentes tripanosomatídeos, infectando cães domésticos em Cuiabá. A caracterização das amostras isoladas a partir do diagnóstico parasitológico é de grande importância para diversos estudos, principalmente àqueles que envolvem a vigilância epidemiológica, possibilitando o mapeamento das espécies e/ou variantes de parasitos que circulam em áreas endêmicas. Um dado importante obtido neste estudo foi o isolamento, pela primeira vez na cidade de Cuiabá, de Trypanosoma caninum. Essa espécie foi descrita primeiramente no município do Rio de Janeiro (Madeira et al., 2009a) e posteriormente em outras regiões do Brasil (Barros et al., 2012). Em nosso estudo, relatamos a presença desse parasito em 14 cães procedentes de quatro bairros estudados. Esses novos isolados, em associação aos já descritos nas cidades de Brasília, Bauru e Belo Horizonte, demonstram a circulação desse parasito e enfatizam a importância da identificação das espécies que 119 estejam infectando os cães nas áreas endêmicas para LV. Outro aspecto que deve ser ainda estudado é o impacto que a circulação desse parasito possa causar nos programas de controle da LV. A descrição do encontro de T. caninum em Cuiabá está descrito nos artigos nºs 1 e 2 desta tese. Até o momento, já foram descritos 53 casos da infecção natural por T. caninum. No entanto, aspectos relacionados a biologia desse parasito são completamente desconhecidos. Dos 14 casos descritos neste estudo, o diagnóstico da infecção, foi feito a partir do cultivo de pele íntegra, reforçando uma característica biológica dessa espécie. Embora a infecção por T. caninum não tenha sido um dos objetivos iniciais deste estudo, o encontro de 14 casos entre os animais estudados, possibilitou a avaliação, mais minuciosa desse grupo de cães e assim contribuir com aspectos relacionados a patogênese e ou virulência desse parasito para os cães, cujos resultados estão apresentados no artigo nº 5 desta tese. Um dado que podemos destacar é a comprovação exclusiva de T. caninum em sítio de pele, como já foi mencionado em outros estudos (Madeira et al., 2009a; Pinto et al., 2010; Silva et al., 2011). O bom estado clínico geral, apresentado por cerca de 70% dos cães infectados por T. caninum, no momento do diagnóstico e durante o monitoramento, sugere que o parasito possa não ser patogênico para os cães, sendo a infecção transitória e cursando sem sinais clínicos específicos. O cão doméstico possui grande importância na manutenção e dispersão da LV e por essa razão, fatores que possam estar associados ao risco do cão adquirir a infecção devem ser bem estabelecidos. Como já dito anteriormente, em Cuiabá, pouco se conhece sobre aspectos da LVC e assim, o nosso estudo visou também, conhecer os índices de soroprevalência canina e estabelecer possíveis fatores de risco que pudessem estar associados à infecção desses animais. Os resultados estão apresentados no artigo nº 3 e demonstraram uma soroprevalência para Leishmania sp. que consideramos elevada (22,1%), 120 frente aos dados obtidos na literatura (Savani et al., 2003; Almeida et al., 2009; Oliveira et al., 2010; Santos et al., 2010). A elevada prevalência da infeção constatada em cães oriundos dos bairros urbanos confirma a tendência de urbanização da LV em Cuiabá como já revelada em outras regiões do Brasil. Entretanto, é importante ressaltar que os bairros rurais também detêm altas taxas da infecção canina, representando um risco de adquirir a doença 1.9 vezes maior em relação aos bairros urbanos. A análise dos fatores de risco, considerando a sorologia, demonstrou que os animais residentes em ambiente rural possuem um risco maior de adquirir a infecção e que hábitos dos animais, como livre acesso a rua e função de guarda foram indicativos preditores da infecção por Leishmania. A presença de plantações no quintal foi um fato que também contribuiu para a ocorrência da infecção. Marzochi e Marzochi, (1994) relataram que tal característica pode estimular o estabelecimento de flebotomíneos nesses ambientes. Apesar dos proprietários possuírem informações sobre a doença nenhuma medida de prevenção foi por eles adotada. A eutanásia dos cães baseada nos resultados dos testes sorológicos como forma de controle para LV tem gerado discussões e direcionando a pesquisa de testes cada vez mais sensíveis e específicos. Neste contexto, a demonstração do parasito e/ou DNA ainda é importante, principalmente em determinadas situações, onde os métodos sorológicos provêm resultados imprecisos (Saridomichelakis, 2009). Tanto para a cultura, como para PCR, diferentes amostras biológicas podem ser utilizadas (Fisa et al., 2001; Manna et al., 2004; Moreira et al., 2007; Maia et al., 2009; Ferreira et al., 2012; Lombardo et al., 2012). Embora resultados diversos sejam apresentados na literatura, ainda não existe um consenso da amostra padrão, devendo-se considerar aspectos relacionados à facilidade da coleta da amostra e do método utilizado (Saridomichelakis, 2009). Nesta pesquisa, utilizando a cultura, o diagnóstico da LVC foi melhor obtido utilizando amostras de pele, entretanto, nos cães assintomáticos, a amostra de medula óssea apresentou maior positividade. Nestes casos 121 a medula óssea foi o único sítio em que se obteve isolamento de L. chagasi (artigo nº 1). Paralelo a cultura, a PCR mostrou-se eficaz em detectar infecção por Leishmania sp. Dos 430 cães pesquisados, 63 cães foram positivos por esta técnica, anticorpos anti-Leishmania sp não foi detectado em 20 cães. A chance de detectar DNA de L. chagasi foi superior nos animais sintomáticos quando comparado aos assintomáticos, como descrito por outros autores (Martinez et al., 2011). Considerando a PCR, o aspirado de linfonodo foi o sítio que demonstrou maior positividade para o diagnóstico da LVC, independente do status clínico do cão. Esse resultado pode sugerir uma constante parasitemia neste sítio em todas as fases clínicas do cão infectado, indicando predileção deste sítio, como descrito por Maia et al. (2009). Entretanto, apesar de 22 cães terem apresentado úlceras cutâneas, tal amostra biológica apresentou resultado positivo, pela PCR, em 59,1% (n=13), apontando que tal sítio possa ser utilizado na pesquisa de DNA de L. chagasi, quando presente nos cães. Os resultados relacionados a utilização da PCR como ferramenta de rastreamento de L. chagasi estão apresentados no artigo nº 4 desta tese. Como forma de verificar a infecção por L. chagasi em cães a utilização de testes sorológicos são amplamente difundidos (Almeida et al., 2009; Oliveira et al., 2010; Santos et al., 2010). Até o ano de 2011, a imunofluorescência indireta (IFI) era o teste confirmatório da LVC, sendo atualmente, substituída pelo teste ELISA (MS, 2011). Como já mencionado anteriormente, a possibilidade de reações cruzadas nos testes sorológicos podem induzir erros em dados relacionados a prevalência da infecção em áreas onde ocorrem outros tripanosomatídeos. Neste estudo, além de T. caninum, descrevemos um caso da infecção por Trypanosoma cruzi em um cão residente em Cuiabá, apresentado no artigo nº 6. No estado de Mato Grosso a doença de Chagas ocorre de forma esporádica e na cidade de Cuiabá têm- se relatos apenas do vetor infectado, sem notificação de casos da forma aguda/ou crônica em 122 humanos ou caninos (Paula et al., 2012). No ciclo domiciliar os cães são considerados importantes reservatórios e, devido a estreita proximidade com o homem, pode representar um fator de risco para a população humana. O caso descrito em nosso estudo foi considerado autóctone e ressalta a importância do correto diagnóstico canino, já que é um animal importante na epidemiologia de diversas zoonoses (Eloy e Lucheis, 2009). Os resultados apresentados neste estudo contribuem para o conhecimento de aspectos da LVC em Cuiabá e apontam para a necessidade da inclusão de ações educacionais e sanitárias nessa cidade, já que é uma região que possui características propícias à instalação da LV, como já foi observado em outras cidades brasileiras. Com relação ao diagnóstico canino, enfatizamos que a utilização de diferentes amostras clínicas, associadas a diferentes técnicas diagnósticas proporcionam um diagnóstico acurado da LVC e auxiliam o diagnóstico diferencial com outros agentes que possam estar circulando nesses animais. O diagnóstico da LVC é complexo. Os animais nas áreas endêmicas podem estar em diferentes fases da infecção. Tanto a técnica quanto a amostra biológica empregada pode interferir no diagnóstico da infecção (Martinez et al., 2011). Em nosso estudo os casos sintomáticos de LVC foram melhor diagnosticados independente da técnica utilizada. Entretanto temos que considerar outros aspectos. Embora a IFI tenha diagnosticado um maior número de animais infectados, deve-se ressaltar que é uma ferramenta de diagnóstico indireta e que reações cruzadas podem ocorrer. A presença de L. chagasi nos 430 cães estudados oriundos do inquérito foi comprovada em 12 casos pela cultura e em 63 pela PCR. É importante mencionar que pela PCR o aspirado de linfonodo foi o sítio que apresentou maior positividade para o diagnóstico, embora este sítio não tenha sido examinado pela cultura. Considerando a complexidade clínica e epidemiológica da LVC, a utilização de ferramentas com princípios distintos, assim como a investigação de diferentes amostras biológicas de cães suspeitos é critério que, segundo nossa opinião, dever ser adotado. 123 A sobreposição de áreas endêmicas, além de dificultar o diagnóstico preciso, favorece o aparecimento de infecções mistas e neste estudo contribuímos com o relato da co- infecção por T. caninum e L. chagasi em dois animais na cidade de Cuiabá, demonstrando que cães podem albergar simultaneamente ambos agentes. É importante também mencionar que o cão doméstico funciona com um dispersor de certas zoonoses, carreando agentes etiológicos de importantes enfermidades (Colwell et al., 2011). A comprovação da infecção natural por L. chagasi e o encontro de agentes como T. caninum e T. cruzi em cães domésticos, são elementos importantes que devem ser considerados na vigilância epidemiológica de Cuiabá. 124 7. CONCLUSÕES 1. A investigação parasitológica, através da cultura, mostrou-se eficaz para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, além de promover o isolamento de outros agentes tripanosomatídeos circulantes em cães, como Trypanosoma caninum; 2. Considerando a cultura, a amostra de pele íntegra foi o sítio que apresentou maior positividade na detecção de L. chagasi nos cães sintomáticos e a medula óssea nos assintomáticos, demonstrando que o status clínico do cão possui influência no resultado da amostra biológica analisada para o diagnóstico parasitológico da LVC; 3. As técnicas de isoenzimas e PCR foram fundamentais para a caracterização dos parasitos das espécies Leishmania chagasi, Trypanosoma caninum e Trypanosoma cruzi, respectivamente; 4. A soroprevalência para infecção por Leishmania sp. foi considerada alta em Cuiabá. O acesso livre à rua, função de guarda, presença de plantações no quintal e, residir em ambiente rural, foram fatores de risco que contribuíram para aquisição da infecção canina nas áreas estudadas; 5. Na PCR, o aspirado de linfonodo poplíteo foi o sítio que apresentou maior positividade para o diagnóstico da LVC, independente do status clínico, representando um bom alvo para utilização em inquéritos epidemiológicos; 6. Na infecção por L. chagasi ou T. caninum, os sinais clínicos apresentados pelos cães não foram considerados como elemento auxiliar para o diagnóstico. 7. A infecção por L. chagasi, T. caninum e T. cruzi diagnosticados em cães domiciliados em Cuiabá demonstram a sobreposição de tais agentes e, considerando tal complexidade, a utilização de ferramentas diagnósticas com princípios distintos deve ser adotado nessa região. 125 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abranches P, Silva Pereira MCD, Conceição-Silva FM, Santana-Gomes GM, Jans JG. 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The objective of this study was the use of parasitological culture as a diagnosis tool and identification of species of Leishmania and other trypanosomatids in the canine population in the city of Cuiaba/Mato Grosso. Biological samples such as blood, intact skin fragments, cutaneous ulcers, and bone marrow were collected during a cross- sectional study and cultured on biphasic medium (Novy-MacNeil-Nicolle [NNN]/Schneider’s). Leishmania isolates were characterized through isoenzyme electrophoresis. Isolates were obtained from 11.2% (n = 54) of the 482 animals studied considering the different anatomical sites investigated. Leishmania chagasi was confirmed in 8.3% (n = 40) dogs and Trypanosoma caninum in 2.9% (n = 14). The sample of intact skin presented a higher chance of isolation of L. chagasi in symptomatic dogs and bone marrow in asymptomatic dogs ( p < 0.05). The results presented in this study emphasize the value of culture and confirm, for the first time, the circulation of L. chagasi in the canine population in different neighborhoods of the city of Cuiaba and broaden the knowledge of the geographical distribution of T. caninum in Brazil. Key Words: Diagnosis—Dogs—Leishmania—Trypanosoma—Vector-Borne. Introduction Leishmania currently affects 12 million people aroundthe world (WHO 2008). In the Americas, visceral leish- maniasis (VL) is an endemic disease, and Brazil is the country that contributes with the highest number of cases. In Brazilian territory, the disease is spreading, and dogs are the main domestic reservoir of the etiological agent [Leishmania (Leish- mania) chagasi] and play a key role in the transmission cycle in urban areas (MS 2006). One of the control measures for VL recommended in Brazil includes a canine serological survey followed by euthanasia of the seropositive dogs. Such a measure, although applied in endemic areas, has been questioned in view of possible cross- reactions obtained in serological tests (Coutinho et al. 1985, Vexenat et al. 1996), mainly in areas of overlapping with other trypanosomatids agents (Madeira et al. 2006, 2009b, Silva et al. 2011). In the state ofMato Grosso (MT), located in central-western Brazil, the first human case of VL was reported in 1973 in the south-central region (Baruffa and Cury 1973); and since then, the disease is spreading mainly associated with migratory process and uncontrolled urban occupation (Mestre and Fontes 2007, Missawa and Borba 2009), as already described for other Brazilian regions (Marzochi et al. 1985, Antonialli et al. 2007). Although the disease has been reported in about 34 municipalities, including the capital (Cuiaba), little is known about the species of Leishmania parasites circulating in 1Programa de po´s-graduac¸a˜o em Pesquisa Clı´nica em Doenc¸as Infecciosas, Instituto de Pesquisa Clı´nica Evandro Chagas, Fundac¸a˜o Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. 2Departamento de Clı´nica Me´dica Veterina´ria, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterina´ria e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Mato Grosso, Brasil. 3Laborato´rio de Pesquisa Clı´nica em Dermatozoonoses de Animais Dome´sticos, Instituto de Pesquisa Clı´nica Evandro Chagas, Fundac¸a˜o Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. 4Laborato´rio de Vigilaˆncia em Leishmanioses, Instituto de Pesquisa Clı´nica Evandro Chagas, Fundac¸a˜o Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. VECTOR-BORNE AND ZOONOTIC DISEASES Volume 11, Number 12, 2011 ª Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/vbz.2011.0723 1555 different hosts and environments, information that is essential both for control actions and epidemiological surveillance. In this context, considering the importance of the domestic dog in the transmission chain of VL and the lack of informa- tion on different aspects of leishmaniasis in Cuiaba/MT, the current study aims at using culture as a diagnostic tool and identification of species of Leishmania and other trypanoso- matids that may be circulating in the canine population. Materials and Methods Area and survey design A cross-sectional studywas conducted in the city of Cuiaba (1535¢56.10¢¢S and 5605¢41.62¢¢W), MT, located in central- western Brazil, comprising the neighborhoods Barreiro Branco, Coxipo´ do Ouro, Osmar Cabral, Bela Vista, and Jar- dim Unia˜o, where cases of human VL were reported (data to be published). The study was conducted in the canine population, sam- pling was defined by the Epi info 3.3.2 program (CDC, Atlanta, GA), considering canine VL (CVL) prevalence of 8.4% (Mestre and Fontes 2007), 99% confidence interval, and acceptable error of 2%, with the population based on canine census held in 2007. The minimum size was estimated at 430 animals, with dogs of both sexes and aged 6 months or more in the period between 2009 and 2010 being sampled. The ex- clusion of puppies aged < 6 months is due to the risks to sedation procedure in this group. The survey was conducted through home visits, considering a residence for every five. In parallel, dogs that were attended at the Veterinary Hospital (HOVET) of the Federal University of MT with suspected leishmaniasis were also included in the study. All procedures performed during this study were ap- proved by the Ethics Committee for Animal Use of the Os- waldo Cruz Foundation, under the protocol number LW-01/ 10. Animals and biological sample collection After obtaining informed consent from the owners, the dogs were mechanically restrained and subjected to sedation with ketamine (10mg/kg) associated with acepromazine (0.2mg/kg) and grouped in asymptomatic, oligosympto- matic, and symptomatic groups, according to Mancianti et al. (1988) criteria. Blood was collected by cephalic or jugular venipuncture and bone marrow through aspiration of the sternum, after local anesthesia with lidocaine 2%, both with anticoagulants. Intact skin tissue samples (scapular region) and samples from cutaneous ulcers, when present, were ob- tained by biopsy, after a procedure that included trichotomy, antisepsis, and local anesthesia, collecting fragments of about 3mm. Parasitological culture and characterization by multilocus enzyme electrophoresis The tissue fragments (skin and cutaneous ulcers) were kept in saline containing 1000U penicillin, 200 lg streptomycin, and 100 lg 5¢-fluorocytocine per milliliter and stored at 4C for 24 h. Then, the samples were seeded in biphasic medium (NNN/Schneider’s) plus 10% fetal bovine serum. Bone mar- row and blood (200–300lL) were seeded directly in the cul- ture medium after collection. All samples were analyzed in duplicates, incubated at 26C–28C, and freshly examined, weekly, during 30 days. Positive cultures (flagellate trypanosomatid found) were grown to obtain parasite mass and cryopreserved at - 196C under liquid nitrogen. Cultures with promastigote isolates were characterized by isoenzyme electrophoresis (Cupolillo et al. 1994), using five enzymatic loci: 6-phosphogluconate dehydrogenase (EC.1.1.1.43); phosphoglucose isomerase (EC.5.3.1.9); nucleoside hydrolase (2 loci, EC.3.2.2.1); glucose- 6-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.49), and phosphoglu- comutase (EC.1.4.1.9). Reference samples of Leishmania braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), and L. chagasi (MHOM/BR/1974/ PP75) were used in all the electrophoretic runs. Samples with isolates of Trypanosoma sp. were analyzed by nested poly- merase chain reaction with targets for the region 18S rRNA whose molecular analysis of the amplified products identified all isolates as Trypanosoma caninum, as shown by Almeida et al. (2011). Data analysis Data obtained were analyzed by the Epi Info 3.3.2 program (CDC/Atlanta), using the Chi-square test (v2) or Fisher Exact Test, when any expected value was p5, and the odds ratios determined with 95% confidence interval. Correlation with age and clinical characteristics of the animal was made be- tween the different sites where parasite isolation was ob- tained. Results Four hundred thirty dogs were evaluated during home visits in the neighborhoods of Barreiro Branco (n = 68) and Coxipo´ do Ouro (n= 53), both located in the North region formed by small properties with rural characteristics and in the neighborhoods of Osmar Cabral (n= 107), Bela Vista (n= 110), and Jardim Unia˜o (n= 92), located in South, East, and North regions with urban characteristics. Fifty-two dogs attended to at HOVET, under spontaneous demand, coming from thirty-four neighborhoods, located in Cuiaba and seven from neighboring municipalities, were studied (Fig. 1). The average age of the 430 dogs assessed in the survey was 4½ years, ranging from 6 months to 14 years. One hundred fifty dogs of this group were considered oligosymptomatic and 42 symptomatic with clinical manifestations of CVL such as dermatologic (119/62%), being the most common alopecia (69/58%), furfuraceous dermatitis (20/16.8%), cutaneous ul- cers (11/9.2%), besides lymphadenopathy (118/61.4%), weight loss (78/40.6%), ophtalmopathy (46/23.9%), spleno- megaly (43/22.4%), and onychogryphosis (35/18.2%). The age of the dogs attended to at HOVET ranged from 7 months to 14 years (average = 4 years and 9 months), 17 of them were oligosymptomatic and 29 symptomatic, and their manifesta- tions were as follows: dermopathy (34/73.9%), as furfurac- eous dermatitis (19/55.9%), cutaneous ulcers (10/29.4%), ophtalmopathy (26/56.5%), onychogryphosis (24/52.2%), lymphadenopathy (20/43.5%), weight loss (12/26.1%), and splenomegaly (10/21.7%). The presence of cutaneous ulcers was observed in 27 (5.6%) animals, considering the total group of animals studied. Parasite isolation was obtained from 54 (11.2%) of the 482 dogs assessed, promastigote and epimastigote forms of which 1556 de ALMEIDA ET AL. were retrieved from 40 and 14 dogs, respectively. Leishmania parasites were isolated from blood in 10 cases, bone marrow in 25, intact skin in 28, and cutaneous ulcers in 4. Simulta- neous isolations in two or three sites were obtained in 19 cases. Epimastigote forms, identified as T. caninum, were ex- clusively isolated from intact skin from 14 dogs (Table 1). Thirteen (24.1%) animals of this group were oligosympto- matic, and 27 (50%) were symptomatic at the time of the collection. At least 1 isolate per animal from the 81 samples where promastigote formswere isolatedwas characterized by isoenzyme. All isolates from cutaneous ulcers were identified. L. chagasi was identified in 82.7% (n = 67) samples, from 40 dogs from the differents neighborhoods at city of Cuiaba. Seven (17.5%) of those animals lived in neighborhoods lo- cated in rural areas and 33 (82.5%) in urban areas. Four of the 28 dogs attended to at HOVET and positive for CVL were from other municipalities such as Nossa Senhora do Livra- mento (2), Va´rzea Grande (1), and Rondono´polis (1). Thirty- three (82.5%) dogs were born in the city of Cuiaba, and three (7.5%) in adjacent municipalities, but with permanent resi- dence for over a year (Fig. 1). Fourteen isolates of T. caninum were obtained from dogs living in Cuiaba, of which 11 (78.57%) were reported to have born in the household (Fig. 1). The intact skin showed numerically higher in parasite iso- lation in relation to other sites surveyed. Positivity at different sites associated with clinical manifestations and age of the dogs is shown in Table 2. When the different sites of isolation of L. chagasi were compared with the clinical categories studied, we found that in symptomatic dogs, parasite isolation was achieved in all sites examined, the sample of intact skin being statistically superior to blood samples ( p= 0.02; odds ratio 4.02, 1.55– 10.76) and lesion ( p = 0.005; odds ratio 5.11, 1.5–19.06); and this difference was not observed for bone marrow ( p= 0.25). The different isolation sites did not present a statistically significant difference ( p= 0.64) in oligosymptomatic dogs. In the group of asymptomatic dogs, L. chagasi was isolated only in bone marrow samples, which is statistically significant ( p = 0.02) compared with other sites. High positive correlation (r= 1) was observed in the different sites related to age and clinical category, thus observing an increase in the number of isolates in adult dogs (> 1 year) compared with young dogs (< 1 year). FIG. 1. Spacial distribution of isolates of Leishmania (Leishmania) chagasi and Trypanosoma caninum detected in dogs in the city of Cuiaba, Mato Grosso, Brazil. Table 1. Leishmania (Leishmania) chagasi and Trypanosoma caninum Isolates and Correlation with Clinical Specimens Analyzed Sites of isolation Number of dogs/ number of isolates Leishmania chagasi isolates Bone marrow 11/11 Skin 10/10 Skin, blood, and bone marrow 7/21 Skin, lesion, and bone marrow 1/3 Skin and lesion 3/6 Skin and bone marrow 5/10 Skin and blood 2/4 Blood and bone marrow 1/2 Total 40/67 Trypanosoma caninum isolates Skin 14/14 Total 54/81 CULTURE TO DETECT Leishmania chagasi IN DOGS 1557 Discussion In Brazil, VL is a growing disease and coordinated actions, thus involving different segments of the epidemiological chain becoming fundamental for its control. Although cases of human VL have been described in Cuiaba, information about the canine disease is based on the results of serological sur- veys (Mestre and Fontes 2007, Almeida et al. 2009), with a large parasitological knowledge gap of these animals (Almeida et al. 2010). Parasitological approaches are not used in epidemiologic studies, mainly due to the large volume of work produced by this activity. However, this practice is essential for knowing and monitoring the agents that may be circulating in endemic areas. In this context, we used the parasitological culture as a diagnostic tool in 482 dogs and we confirmed the presence of L. chagasi and T. caninum for the first time in the city of Cuiaba. Forty dogs with different clinical conditions were found to be naturally infected by L. chagasi, thus demonstrating the CVL prevalence of 8.3%, a similar result to that found by Mestre and Fontes (2007), using serological data. Parasite isolation in culture is considered a reference standard for di- agnosis of leishmaniasis, thus showing high specificity and variable sensitivity, according to culture conditions. One drawback of this technique is the possibility of bacterial or fungal contamination, which in our study was low, found in 23 (1.6%) of the 1462 samples processed for this method. The use of different biological samples for the diagnosis of CVL has been investigated through different techniques (Madeira et al. 2006, Maia et al. 2009, Assis et al. 2010). Manna et al. (2004) describe the use of aspirates or biopsies of lymph node, spleen, bone marrow, and liver in the detection of DNA of Leishmania sp., although they describe samples of blood, skin, and conjunctiva as less invasive and with good results. In this study, the use of skin fragments, blood, and aspirate of bone marrow occurred in 100% and 97.7% of the animals as- sessed, thus showing good results in relation to the ease of obtaining these clinical samples. Authors point out the skin as an important site for Leish- mania detection due to its high parasite load in both asymp- tomatic and symptomatic animals (Lima et al. 2010, Queiroz et al. 2011). In the study conducted by Madeira et al. (2009a), where 394 dogs seropositive for leishmaniasis were investi- gated, L. chagasi was isolated from the skin in 78% of the animals studied. In the current study, 70% of the isolates with L. chagasi were from the skin, thus reinforcing this site as a good target for parasitological investigation of CVL. Bonemarrowwas the best site for isolation in asymptomatic dogs, whereas skin was for oligosymptomatic and symptom- atic ones. The chance to isolate the agent from the skin of the latter was four or five times greater than from samples of blood or cutaneous ulcer, respectively. According to Tafuri et al. (2001), L. chagasi seems to spread initially to organs of the re- ticulo endothelial system, such as bone marrow, to be found later on the skin,which could explain the fact of L. chagasi being isolated only from bone marrow in asymptomatic dogs. The isolation of L. chagasi fromdifferent sites in symptomatic dogs proves that the agent spread to various organs of the animal (Madeira et al. 2006, Maia et al. 2009). This fact may be related to the parasite load in symptomatic animals (Lima et al. 2010), thusmaking it easier to diagnose in this group of animals as proved by Queiroz et al. (2010) when using several meth- odologies for VL diagnosis in dogs with and without clinical symptoms. For Maia et al. (2009), the infection difference of diverse organs of the same animal may be associated to the potential parasite load and related with the local immune re- sponse of the organ. These data show that parasite isolation on a particular site is conditioned to the clinical status of the ani- mal. On the other hand, the long incubation period in VL has been associated with the predisposition of adult dogs to de- velop the disease (Arias et al. 1996), an aspect that could explain the high correlation found in the isolation of L. chagasi in adults dogs evaluated in this study. Euthanasia of seropositive dogs, with titers equal to or above 1:40 for immunofluorescence tests, is one of the control measures used for VL in Brazil (MS, 2006). However, the possibility of cross-reactions should be considered mainly in areas of overlapping with other agents. The state of MT is considered endemic both for VL and tegumentary leishman- iasis (TL) forms. Although L. braziliensis was not isolated from the dogs studied, the circulation of this species should not be disregarded given the small number of dogs with ulcers suggestive of TL evaluated, besides the proved circulation of this agent in the state and the occurrence of TL cases in the municipality of Cuiaba (Carvalho et al. 2006). Parasite isolation is important for several studies besides confirmation of diagnosis, mainly those involving epidemio- logical surveillance, thus making it possible, through the characterization of the parasites found, the mapping of the species and/or parasite variants circulating in endemic areas. A fact revealed by this study, obtained by the use of culture method, was the isolation of T. caninum for the first time in the city of Cuiaba. This parasite was found in fourteen dogs from four of the five neighborhoods surveyed, from which eleven were born in the house visited. This species was initially de- scribed in the municipality of Rio de Janeiro (Madeira et al. 2009b), and these new reports suggest that the parasitemay be circulating in different Brazilian regions and emphasize the importance of identifying the species infecting seropositive dogs in endemic areas. In this study, the 14 samples in which T. caninum was iso- lated were all from intact skin reinforcing a biological Table 2. Results of Clinical and Parasitological Diagnosis (Culture) Performed with Different Clinical Specimens Obtained from 482 Dogs Parasitological test (n/+ ) Dog’s date (n = 482) Blood Intact skin Cutaneous ulcers Bone marrow Clinical status and age Symptomatic < 1 year 07 (01) 07 (02) 02 (01) 07 (02) > 1 year 64 (07) 64 (22) 12 (03) 57 (13) Olygosymptomatic < 1 year 17 (00) 17 (00) 02 (00) 17 (00) > 1 year 150 (02) 150 (09)a 11 (00) 148 (05) Asymptomatics < 1 year 42 (00) 42 (03)b 00 (00) 42 (01) > 1 year 202 (00) 202 (06)c 00 (00) 200 (04) a05 samples identified as T. caninum. b03 samples identified as T. caninum. c06 samples identified as T. caninum. n, number of samples tested;+ , number of positive samples. 1558 de ALMEIDA ET AL. characteristic of this species as already mentioned in other studies (Madeira et al. 2009b, Pinto et al. 2010). In none of these animals, Leishmania was isolated in the other sites evaluated. Overlapping in endemic areas for leishmaniasis, occurrence of coinfection (Madeira et al. 2009b), and isolation of T. caninum in dogs seropositive for leishmaniasis as ob- served by Pinto et al. (2010) suggest that surveillance actions should be implemented, considering the interference of such aspects in the prevalence of CVL. The spatial distribution of L. chagasi in Cuiaba demon- strates the circulation of this agent in all administrative dis- tricts of the municipality, thus allowing to safely define the transmission areas for VL (Missawa and Borba 2009). The largest number of isolates was obtained in the North district, where human and canine cases have been diagnosed as de- scribed by Almeida et al. (2010). The use of culture in this study confirmed the autochthony CVL cases, and proved the circulation of L. chagasi in the ca- nine population in different neighborhoods of Cuiaba as well as in neighboring municipalities. In addition, it provided relevant epidemiological information, thus highlighting the finding of T. caninum, first described in the city of Cuiaba. Acknowledgments The authors thank Eduardo da Silva Machado for his technical support in preparation of culture media and isoen- zyme technique. This work was supported, in part, by grants from the Fundac¸a˜o de Amparo a Pesquisa do estado de Mato Grosso and CNPq (process n 474894/2010-0). Disclosure Statement No competing financial interest exist. References Almeida, ABPF, Barros, JHS, Sousa, VRF, Boa Sorte, EC, et al. Encontro de Trypanosoma caninum em ca˜es, na cidade de Cuiaba´, Mato Grosso, Brasil. In: Anais do XLVII Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Sociedade Brasileira de Medicine Tropicale, Natal-RN, 2011:668. Almeida, ABPF, Faria, RP, Pimentel, MFA, Dahroug, MAA, et al. Inque´rito soroepidemiolo´gico de leishmaniose canina em a´reas endeˆmicas de Cuiaba´, Estado de Mato Grosso. 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Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 106 (2012) 419– 423 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene j ourna l ho me pag e: ht t p: / /www.e lsev ier .c Occurr eas leishm pa control J.H.S. Bar R.F. S A.G.S. Pin a Laboratório d , Fundac Rio de Janeiro, RJ, Brasil b Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Mato Grosso, Av. Fernando Correa da Costa, S/N, campus da UFMT, Boa Esperanc¸ a, Cuiabá, MT, Brasil c Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos, Instituto de Pesquisa clínica Evandro Chagas, Fundac¸ ão Oswaldo Cruz, Av. Brasil, 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil a r t i c l Article history: Received 20 M Received in re Accepted 30 M Available onlin Keywords: Trypanosomat Dogs 18S rRNA gene Nested-PCR 1. Introdu The gen parasites th According t tissues, un respectively inum, was d Janeiro, Bra ments; atte from natur ∗ Correspon E-mail add 0035-9203/$ – http://dx.doi.o e i n f o ay 2011 vised form 30 March 2012 arch 2012 e 10 May 2012 idae a b s t r a c t Trypanosoma caninum is a parasite of the Trypanosoma genus recently described in the nat- ural infection of dogs in the municipality of Rio de Janeiro, Brazil. Suspecting the existence of a natural cycle and the circulation of this new species, the objective of this study was the taxonomic identification of samples of Trypanosoma spp. isolated from dogs in different Brazilian regions. Parasites were solely obtained from skin fragments culture and charac- terized by nested-PCR targeting the partial sequence of 18S rRNA gene and PCR products were sequenced. Thirty-three samples, obtained in São Paulo, Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso and Rio de Janeiro states were analyzed. PCR and sequencing showed that the iso- lates were genetically identical or closely similar and confirmed T. caninum identity. This report broadens the geographical distribution of T. caninum in Brazil and discusses the impact of the presence of this parasite in areas of canine leishmaniasis occurrence. © 2012 Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved. ction us Trypanosoma includes a complex group of at infect a broad range of hosts worldwide. o the species, they may infect blood or other der the trypomastigote or amastigote forms, .1 Recently, a new species, Trypanosoma can- escribed in domestic dogs in the state of Rio de zil, isolated into culture from intact skin frag- mpts to isolate it from blood or other tissues ally infected dogs did not succeed.2,3 Aspects ding author. Tel.: +55 21 21 38659541. ress: juliana.helena@ipec.fiocruz.br (J.H.S. Barros). related to the biological forms present in the vertebrate host and its natural cycle are still unknown. However, molecular characterisation shows it is not related to T. cruzi or T. rangeli, and analysis of partial SSU ribosomal DNA sequences give T. pestanai and a wombat trypanosome as the closest matches. In Brazil, visceral leishmaniasis (VL) is a serious public health problem and the domestic dog is one of the tar- gets for control actions because it is considered a major reservoir of Leishmania (L.) chagasi (= L. infantum), the VL etiological agent.4 The Brazilian leishmaniasis control program recommends diagnosis and euthanasia of sera reactive dogs as control measures for VL.5 In this context, the presence of other trypanosomatids, besides Leishmania parasites, infecting domestic dogs in overlapping areas, see front matter © 2012 Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved. rg/10.1016/j.trstmh.2012.03.014ence of Trypanosoma caninum in ar aniasis in Brazil: what is the real im ? rosa,∗, A.B.P.F. Almeidab, F.B. Figueiredoc, V. toa, C. Baptistaa, M.F. Madeiraa e Vigilância em Leishmanioses, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagasom/ locate / t rs tmh overlapping with ct of canine leishmaniasis ousab, A. Fagundesa, ¸ ão Oswaldo Cruz, Av. Brasil, 4365, Manguinhos, 420 J.H.S. Barros et al. / Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 106 (2012) 419– 423 may constitute a confounding factor in canine diagno- sis, since surveys are based on serological tools for the identification of positive animals. Our tea genetic var and sample these studie phological patterns ve identificatio come from that T. canin Thus, the o samples of the presenc where case 2. Materia 2.1. Sample The sam surveys of diagnosis o Janeiro, com Niterói and Horizonte); each of thes of both sexe Only house ical examin parasite iso 2.2. Isolatio Three ap collected fr and one w isolation in saline cont penicillin a stored at 4 by Madeira transferred (Novy-Neal (Sigma, St. serum, incu maximum tained in th and expand 109 parasit washed in nitrogen to 2.3. Molecu Genomi using DNAz samples, th DNA purific The manuf procedures. The PCR amplifications were perfomed in a nested-PCR that targeted a partial sequence of the 18S rRNA gene using oligonucleotides and reaction con- ns as 27F (5 ACTG intern A 3′) ere u run o ide, a ified p red fo uick P g the ences w DNA . All n edite ment bad, C ://blas nts w ample e Gen alX pro ared ther t sults Sample irty-th dogs is (Bel o (Cui Niter ucted ned fr ion of l isol lture, um, a ry con gh the ample ere p red fo PCR an e resu n patt m skin e firs encing genet ninum and t 1.m has monitored Leishmania species and the iants that may be infecting domestic dogs,6 s of Trypanosoma spp. were isolated during s from different Brazilian endemic areas. Mor- and biological aspects of these isolates show ry similar to T. caninum, however, the correct n of these isolates is fundamental, since they VL endemic areas and evaluating the impact um has in those areas is still a great challenge. bjective of this study was to characterize 33 Trypanosoma spp. isolated from dogs and report e of T. caninum in different Brazilian regions, s of canine VL occur. ls and methods s ples for this study were obtained during domestic dogs, the objective of which was the f canine VL conducted in the states of Rio de prising the municipalities of Rio de Janeiro, Maricá; São Paulo (Bauru); Minas Gerais (Belo Mato Grosso (Cuiabá) and Goiás (Brasília). In e regions dogs were randomly evaluated, dogs s and aged six months or more being sampled. d dogs participated in the study, and after clin- ation intact skin fragments were collected for lation in culture and molecular analysis by PCR. n of parasites from dogs proximately 3 mm sized skin fragments were om each animal; two were culture processed as frozen at −20 ◦C for molecular studies. For culture the skin fragment was immersed in aining 100 g of 5′fluorocytocine, 1000 IU of nd 200 g of streptomycin per milliliter and ◦C for 24 h according to the protocol described et al.7 After this period, each fragment was aseptically to a biphasic culture medium NNN -Nicolle) and Schneider’s Drosophila medium Louis, MO, USA) containing 10% of fetal calf bated at 26–28 ◦C and examined weekly for a of 50 days. The parasites isolated were main- e same culture medium, weekly subcultured ed in Schneider’s medium until reaching about es/mL. The parasites were harvested and twice PBS pH 7.2 and the pellets stored in liquid be used in molecular assays. lar analysis c DNA of cultured trypanosomes was extracted ol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and for skin e DNA was extracted using Wizard® Genomic ation kit (Promega, Madison, Wisconsin, USA). acturer’s instructions were followed in both ditio TRY9 (5′ CT and GAGC 3′) w were brom ampl cultu QIAq lowin sequ (3730 USA) were Align Carls (http perce the s in th Clust comp and o 3. Re 3.1. Th from Gera Gross n = 7, cond obtai locat Al in cu medi onda throu son, s lost w cultu 3.2. Th catio 7 fro for th sequ were T. ca lates Tabledescribed by Smith et al.8 External primers ′ GAAACAAGAAACACGGGAG 3′) and TRY927R GGCAGCTTGGA 3′) were used in the first round al primers SSU561F (5′ TGGGATAACAAAG- and SSU561R (5′ CTGAGACTGTAACCTCAAAGC sed in the second round. The PCR products n a 1.5% agarose gel, stained with ethidium nd visualized under UV light. After PCR, the roducts obtained in the second round with rms or skin fragments were purified using the urification Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) fol- manufacturer’s instructions and the nucleotide ere determined with an automatic sequencer Analyzer, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, ucleotide sequences obtained in this study d by the Bioedit program (BioEdit Sequence Editor version 7.0.5.2, Ibis Therapeutics; A, USA)) and analyzed by the Blast program t.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). The similarity ere obtained comparing the 33 isolates with of T. caninum (stock A27) already deposited Bank (Accession no. GU385824).3 Using the gram,9 all sequences studied were aligned and each other and with sequences of T. caninum rypanosomatids available in GenBank. s ree samples of Trypanosoma spp. were isolated in the states of São Paulo (Bauru, n = 6), Minas o Horizonte, n = 3), Goiás (Brasília, n = 3), Mato abá, n = 12) and Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, ói, n = 1 and Maricá, n = 1) during the surveys between 2005 and 2011. All samples were om intact skin cultures, and the geographical the animals is shown in Figure 1. ates showed similar morphological aspects with exuberant growth in NNN/Schneider’s lthough seven samples were lost due to sec- tamination or because of reduced growth subcultures of the initial isolate. For this rea- s of the skin of the animals whose cultures were rocessed by PCR, using the same protocol as the rms. d data analysis lts of PCR assays showed the same amplifi- ern for all 33 samples (26 from culture and ), with product size of approximately 900 bp t round and 700 bp for the second round. The of the partial 18S rDNA showed that the isolates ically identical or closely similar and confirmed identify. The similarity percents of the iso- he access number in GenBank are shown in J.H.S. Barros et al. / Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 106 (2012) 419– 423 421 Figure 1. Geographical origin of Trypanosoma caninum stocks described to date in Brazilian states: MT (Mato Grosso), GO (Goiás), MG (Minas Gerais), SP (São Paulo) and RJ (Rio de Janeiro). Cases described in this study () and cases already published by Madeira et al.2 and Pinto et al.3 (). Table 1 Data of the stocks of Trypanosoma caninum analyzed in this study Sample code Year of isolation Localization (State/municipality) Sample used for characterisation Accession number GenBank Similaritya (%) RJ8150 2011 RJ/Maricá Culture JF951431 99 RJ002 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907507 99 RJ016 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907508 99 RJ058 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907509 98 RJ066 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907510 99 RJ071 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907531 97 RJ134 2008 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907523 97 RJ4814 2007 RJ/Rio de Janeiro Culture JF907517 97 RJ4052 2005 RJ/Niterói Culture JF907516 96 SP137 2008 SP/Bauru Culture JF907518 99 SP269 2008 SP/Bauru Culture JF907519 99 SP350 2008 SP/Bauru Skin JF907525 99 SP301 2008 SP/Bauru Skin JF907526 98 SP385 2008 SP/Bauru Skin JF907527 99 SP393 2008 SP/Bauru Skin JF907528 99 GO533 2008 GO/Brasília Skin JF907529 99 GO705 2008 GO/Brasília Skin JF907530 99 GO718 2008 GO/Brasília Culture JF907522 99 MG610 2007 MG/Belo Horizonte Skin JF907524 99 MG764 2007 MG/Belo Horizonte Culture JF907520 99 MG771 2007 MG/Belo Horizonte Culture JF907521 99 MT769 2011 MT/Cuiabá Culture JF907535 98 MT798 2011 MT/Cuiabá Culture JF907536 98 MT799 2011 MT/Cuiabá Culture JF907537 99 MT808 2011 MT/Cuiabá Culture JF907538 98 MT527 2009 MT/Cuiabá Culture JF907511 99 MT531 2009 MT/Cuiabá Culture JF907513 99 MT534 2009 MT/Cuiabá Culture JF907532 98 MT576 2009 MT/Cuiabá Culture JF907514 97 MT577 2009 MT/Cuiabá Culture JF907515 96 MT604 2009 MT/Cuiabá Culture JF907512 98 MT669 2009 MT/Cuiabá Culture JF907533 99 MT732 2009 MT/Cuiabá Culture JF907534 98 a The similarity percents were obtained comparing the 33 isolates with the sample of T. caninum stock A27 (accession no. GU385824) by Blast program. GO: Goiás, MG: Minas Gerais, MT: Mato Grosso, RJ: Rio de Janeiro, SP: São Paulo. 422 J.H.S. Barros et al. / Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 106 (2012) 419– 423 4. Discussion The Trypanosoma genus comprises numerous species already des study gives new specie identified i described i and now, f this parasi Mato Gross described i of 53 cases These data of a natura epidemiolo Most o healthy do non-pathog investigate patible wit caninum m infected do cross-react hypothesis Silva et al.1 dogs which programs i Leishmania The cross r e.g., Leishm been report in Brazil5 a the transm impact VL euthanasia The fact related to th isolated, sin usually sear intact skin team has u years,12 wh new Trypan obtained up this site; al failed. In this partial SSU taxonomica different Br to date in a pestanai an most simila sequences T. caninum within this similar pat study and t described b the molecu the samples isolated in culture, was also able to amplify the DNA of T. caninum in skin fragments, showing that PCR directed to a selected target can be a useful tool for olecu al sam regar tivity ach o natura umero need orms vector revale nce m es occ e obs caninu miolo bution ates th nd dif nside ew pa e cont ogical si an g T. ca aspec ors’ c ned th ally re A, FBF AF, AG nterpr version owled meida We al PDTIS- les in nical R lva Bar a Evan ing: T squisa quisa Consel ológico peting al app was a imals /06 ancribed and associated to different hosts. This information about Trypanosoma caninum, a s of this genus, about which little is known, n canine natural infection. This parasite was n the municipality of Rio de Janeiro in 20032 or the first time, we report the presence of te in the states of São Paulo, Minas Gerais, o and Goiás, which added to the cases already n the state of Rio de Janeiro2,3 gives a total of canine natural infection by this parasite. clearly show the circulation and the existence l cycle of T. caninum and calls attention to an gical scenario newly described in Brazil. f the time T. caninum was isolated from gs, suggesting that this parasite might be enic in dogs, although this fact has not been d since one dog presented clinical signs com- h canine VL. It is a matter of concern that T. ight stimulate the humoral immune system of gs, producing specific antibodies that might with Leishmania in serological tests. This is based on the reports of Pinto et al.3 and 0 who isolated T. caninum from seroreactive were euthanized by leishmaniasis control n the municipality of Rio de Janeiro although parasites were not isolated from these animals. eactivity between different trypanosomatids, ania and T. cruzi in canine infection has already ed.11 Considering that VL is a growing disease nd that the domestic dog has a relevant role in ission cycle, this hypothesis, if true, will deeply control and will initiate discussions on canine based solely on serological tests. of T. caninum being recently described may be e anatomical site where this parasite has been ce the parasites of Trypanosoma genus are not ched for in the skin. In addition, few studies use in the diagnosis of canine VL. Fortunately, our sed this site for canine VL diagnosis for many ich allowed isolation and identification of this osoma species. All the samples of T. caninum to this moment were isolated exclusively from l the attempts of isolation from hemoculture study, we demonstrate that the analysis of ribosomal DNA sequence was enough to lly identify the 33 samples isolated from azilian regions and grouped all stocks reported single clade (data not shown). Although the T. d the wombat trypanosome appear to be the r trypanosomes, only part of the partial 18S can be aligned with some reliability, and the sequence is substantially different from others group. Biological aspects had already revealed terns between the samples described in this he sample of T. caninum (stock A27) previously y Madeira et al.2 It is important to mention that lar target selected in this study to characterize the m clinic with sensi appro dogs N ology the f sion the p prese speci Th by T. epide distri indic tion a Co this n in th serol chaga amon more Auth desig critic ABPF data. and i final Ackn de Al map. ing ( samp in Cli da Si Clínic Fund de Pe à Pes and Tecn Com Ethic dogs of An L-023lar tracking of this parasite directly in different ples of dogs from endemic areas. Therefore, ds to this point and considering the limited of culture, further study, using molecular n blood samples and other anatomical sites in lly infected by T. caninum is in progress. us aspects of T. caninum biology and epidemi- to be investigated, e.g., the morphology of present in the vertebrate host; the transmis- ; the possible pathogenic potential for dogs; nce of this parasite; and the impact that its ay cause in areas where other trypanosomatid ur, especially those of the Leishmania genus. ervation of autochthonous cases of infection m in different VL areas in Brazil is an alert for gical surveillance. An overlapping geographical of both T. caninum and Leishmania parasites e need for techniques to ensure the identifica- ferentiation of these agents in canine infection. ring the lack of information that we have about rasite, and the importance of such knowledge ext of public health, studies to evaluate the cross reactivity between T. caninum and L. d description of the genetic polymorphism ninum stocks are in progress and aim to clarify ts of this new parasite. ontributions: JHSB and MFM conceived and e study. JHSB drafted the manuscript. MFM vised the manuscript for intellectual content. and VRFS conducted fieldwork and analysed the SP and CB participated in the laboratory tests eted the data. All authors read and approved the . JHSB and MFM are the guarantors of the paper. gements: We thank Arlene BM Paula Ferreira for the inestimable help in the preparing the so thank the Genomic Plataform-DNA Sequenc- Fiocruz) for supporting the sequencing of the this study. This research is part of the PhD thesis esearch in Infectious Disease of Juliana Helena ros in the program of the Instituto de Pesquisa dro Chagas (IPEC), Rio de Janeiro, RJ, Brazil. his study was partly supported by the Instituto Clínica Evandro Chagas (Programa de Incentivo e Desenvolvimento Tecnológico - PIPDT/2009) ho Nacional de Desenvolvimento Científico e (CNPq – process no 474894/2010-0). interests: None declared. roval: The collection of biological samples of pproved by the Ethics Committee on the Use of FIOCRUZ (CEUA/FIOCRUZ), license numbers d LW-1/10. J.H.S. Barros et al. / Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 106 (2012) 419– 423 423 References 1. Hoare CA. The trypanosomes of mammals: a zoological monograph. Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1972. 2. Madeira MF, Sousa MA, Barros JHS, et al. Trypanosoma caninum n. sp. 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FULL ARTICLE Canine Visceral Leishmaniasis: Seroprevalence and risk factors in Cuiabá, Mato Grosso, Brazil Leishmaniose Visceral Canina: Soroprevalência e fatores de risco em Cuiabá, Mato Grosso, Brasil Arleana do Bom Parto Ferreira de Almeida1,2*; Valéria Régia Franco Sousa2; Felipe Augusto Constantino Seabra da Cruz2; Magyda Arabia Araji Dahroug1; Fabiano Borges Figueiredo3; Maria de Fátima Madeira4 1Programa de pós-graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz - IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil 2Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT, Cuiabá, MT, Brasil 3Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses de Animais Domésticos, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz- IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil 4Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz - IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil *Corresponding author: Arleana do Bom Parto Ferreira de Almeida Hospital Veterinário da UFMT, Departamento de Clínica Médica Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso. Av. Fernando Correa da Costa, 2367, CEP 78060-900, Cuiabá, MT, Brasil e-mail: arleferreira@gmail.com Abstract In Brazil, canine visceral leishmaniasis (CVL) is endemic and the number of cases in humans and dogs has increased in the Midwest region. A transversal study was carried out in endemic areas from Cuiabá, State of Mato Grosso, to assess data on seroprevalence and risk factors associated to canine infection. Four hundred and thirty 2 (430) dogs were randomly evaluated through indirect fluorescence antibody test (IFAT) considering variables related to the animals, the environment and the knowledge by owners on CVL aspects and control. From 430 dogs, 95 (22.1%) were seroreagent for leishmaniasis and animals living in rural environments present risk 1.9 times higher for acquiring the disease than those in urban environments (p=0.01; OR 1.9). Factors related to animals’ habits, such as free access to the street and guard function were considered indicators to predict infection by Leishmania sp. (p < 0.05) by statistical univariate analysis. The presence of agricultural activities was also a fact that contributed for the insurgence of the infection (p = 0.02; OR 1.68). The results contributed to the knowledge on the aspects of CVL in Cuiabá and point to an urgent need to include educational and sanitary programs in the city, since the region presents favorable characteristics for spreading the infection of CVL as already observed in other Brazilian cities. Keywords: Canine visceral leishmaniasis, dogs, risk factors, infection, Brazil. Resumo No Brasil, a leishmaniose visceral canina (CLV) é endêmica e, na região Centro- Oeste, o número de casos em humanos e cães tem aumentado. Um estudo transversal foi realizado em áreas endêmicas de Cuiabá (MT) com objetivo de avaliar dados sobre a soroprevalência e determinar os fatores de risco associados à infecção canina. Quatrocentos e trinta (430) cães foram aleatoriamente avaliados pelo teste de imunofluorescência indireta, considerando-se variáveis relacionadas aos animais, o ambiente e o conhecimento por parte dos proprietários sobre aspectos da CLV e seu controle. Dos 430 cães, 95 (22,1%) apresentaram-se soros reagentes para leishmaniose, e os animais que viviam em ambiente rural apresentaram risco 1,9 vezes maior de adquirir a infecção dos que aqueles em ambiente urbano (p = 0,01; OR 1,9). Fatores relacionados aos hábitos dos animais, tais como o livre acesso à rua e função de guarda, foram considerados indicadores para prever a infecção por Leishmania sp. (p.<0,05) em análise estatística univariada. A presença de atividade agrícola foi também um fato que contribuiu para a ocorrência da infecção (p = 0,02; OR 1,68). Os resultados contribuem para o conhecimento sobre os aspectos da CVL em Cuiabá e apontam para uma necessidade urgente de incluir ações educativas e sanitárias na cidade, já que a região 3 possui características favoráveis para a dispersão da doença como já observado em outras cidades. Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina, cães, fatores de risco, infecção, Brasil. Introduction In Brazil, the country with the highest register of cases of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) in the Americas (WHO 2008), the disease is caused by Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi). In the transmission chain, wild and domestic dog reservoirs and two species of Phlebotominae: Lutzomyia longipalpis and L. cruzi (MS, 2006) are be highlighted. The chronic disease is the most severe clinical form of leishmaniasis and a serious problem for Brazilian public health, mainly due to the high prevalence and increased number of cases in humans and dogs in urban and suburban areas of large cities (ARIAS et al., 1996; MORENO et al., 2005; MARZOCHI et al., 2009). CVL urbanization has been associated to migration processes linked to the deterioration of social and economic conditions of the population (ANTONIALLI et al., 2007; HARHAY et al., 2011). Thus, an expansion of the disease to areas considered non- endemic has also been noticed in several Brazilian regions (De PAULA et al., 2009; SOUZA et al., 2009). In the State of Mato Grosso (MT), in the Midwest region of country, the first report of human leishmaniasis dates from 1973 (BARUFFA; CURY, 1973); however, dissemination of the disease to many municipalities was observed in 1998, including Cuiabá, the capital city of the state (MESTRE; FONTES, 2007). In 2010, 313 cases of human visceral leishmaniasis (VL) were registered in Midwestern Brazil, with the State of Mato Grosso contributing with 54 cases (MS, 2011). Many risk factors to the occurrence of CVL have been determined, indicating possible interactions between the links that compose the epidemiological chain, such as vector, host, reservoirs and environment (GAVGANI et al., 2002; MURRAY et al., 2005; RANJAN et al., 2005; AMORA et al., 2006; RONDON et al., 2008). Thus, the knowledge of the disease distribution in endemic areas and possible associations between the disease and determinant factors may be helpful in control strategies (FREHSE et al., 2010). In this context, the domestic dog plays an important role, 4 maintaining and spreading the disease. For this reason, factors that may be associated to the risk of infection to these animals must be well known (DANTAS-TORRES, 2009). Thus, this research investigated the seroprevalence of CVL and the main risk factors associated to the infection of domestic dogs in the following neighborhoods: Barreiro Branco, Coxipó do Ouro, Osmar Cabral, Bela Vista and Jardim União, which are endemic areas in Cuiabá (MT), where cases of human disease have been reported. Materials and Methods Study Area Transversal study carried out in Cuiabá (MT), from July 2009 to December 2010. The municipality is located at the following coordinates: 15º35’56.10’’S and 56º05’41.62’’O, comprising an area of 3,538 km2, 165 meters above sea level, with predominant savanna vegetation. It presents hot and sub-humid tropical climate with 1750 mm average annual rainfall and maximum temperature around 43°C during the warmest months and minimum temperature between 12°C and 14°C. Cuiabá has a population of 551,098 inhabitants; it is subdivided in four regions (IBGE, 2011). The evaluation of the dogs was performed in the neighborhoods located in the North region (Barreiro Branco and Coxipó do Ouro), which present rural characteristics, and in the neighborhoods located in the South, East and West regions: Osmar Cabral, Bela Vista and Jardim União, respectively, with urban environmental characteristics. Cases of human VL have already been described (data not published) in all the neighborhoods studied. Description of the animals Four hundred and thirty dogs of both genders and age equal or greater than six months were investigated. Canine sampling was defined considering disease prevalence of 8.4% (MESTRE; FONTES, 2007), with a significance level of 2% and 99% confidence interval based on the 2007 canine census. The survey was conducted through home visits, considering one residence for every five. After obtaining the owners’ consent, the dogs were examined and clinically grouped according to Mancianti 5 et al. (1988) for CVL in asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic. About 5mL of blood were collected from each animal by cephalic or jugular puncture; the serum was then separated by centrifugation and kept at -20 ºC until serological test performance. This experiment was approved by the Ethics Committee on Animal Use of the’ Oswaldo Cruz’ Foundation - protocol nº LW-01/10. Serological Test for Diagnostics - Indirect Fluorescence Antibody Test –IFAT The serological analysis was carried out by IFAT technique using a commercial canine visceral leishmaniasis kit (BioManguinhos®/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil) following manufacturer’s recommendations. The serum samples were diluted to the double from 1:40 to 1:640, samples with titer equal or superior to 1:40 were considered reagent, using control sera (positive and negative) included in the tests as reference. Studied variables Information was collected from the owners of the animals in order to describe the general and individual characteristics of the canine population and their environment, as well as to determine the risk factors associated to canine leishmaniasis infection in Cuiabá (MT). The following variables were considered: race (when it could be defined); gender (male, female); age (≤1 year, 1 to 3 years, 3 to 6 years, >6 years, and indefinite); house role (guard, hunt, company); and animal habitat (limited to the interior of the house, peridomiciliar, free access to the street). The variables related to the household environment were the following: household close to agricultural activities; presence of other domestic animals (yes / no); presence of trees and animal breeding at the yard (yes / no); public garbage collection (yes/ no); and knowledge on the occurrence of canine and human VL in the neighborhood (yes / no). Statistical Analysis The chi-square with Yate’s correction and Fisher’s exact test was used to test for associations between all of the parameters (Epi Info software, version 3.5.1, Center for Disease Control, Atlanta, USA). Differences were considered significant for P-values < 6 0.05. Any parameters statistically linked to seropositivity were used in a logistic regression model to assess risk factors associated with seropositivity results. Results From the 430 dogs studied, 95 were seropositive to the IFAT tests showing 22.1% prevalence of CVL. Considering the origins of the animals, those from neighborhoods located in urban areas represented 18.8% of prevalence and in rural neighborhoods, 30.6% of prevalence, which was statistically significant (p = 0.01) (Table 1). The serological titers presented the following frequency: 1:40 (n = 27; 28.4%), 1:80 (n = 32; 33.7%), 1:160 (n = 16; 16.8%), 1:320 (n = 6; 6.3%), 1:640 (n = 14; 14.7%). From 95 seropositive dogs, 44 (46.3%), 35 (36.8%) and 16 (16.8%) were clinically classified as asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic, respectively, with statistical significance between symptomatic and asymptomatic dogs (p = 0.008). The most frequently clinical signs were related to the skin (n = 37; 38.9%), such as dull fur, generalized alopecia, cutaneous ulcers and scaling followed by lymphadenomegaly (n = 34), loss of weight (n = 24), splenomegaly (n = 18), vision disorders (n = 14), onychogryphosis (n = 13), apathy (n = 12), muscular atrophy (n = 4), and cachexia (n = 2). The association of CVL between gender, age or race was not statistically significant (p > 0.05). Six out of the 14 dogs were Pit Bulls, three were Pinschers and there was one of each of the following races: Brazilian Fila, Rottweiler, Poodle, Cocker Spaniel and Chow Chow. The fur type characteristic was also not significant for the occurrence of infection in the dogs; however, variables such as access to the street, guard role and staying most of the time outside the house, represented predictive characteristics for CVL in univariate analysis when compared with dogs kept inside or around the houses (Table 2). Regarding to the origin of CVL seropositive dogs, 87 (91.6%) were from Cuiabá, eight (8.4%) from neighbor municipalities and one from another State (Mato Grosso do Sul). Seventy-five (78.9%) were living with the family for over a year. The presence of other domestic animals and livestock in the rural area did not present association with seroreactivity for leishmaniasis (p > 0.05); in contrast with the presence of crops around 7 the household (uni and multivariate analysis), which was statistically significant (Table 3). Knowledge about the CVL disease was reported by 69.3% (n = 298) of dog owners. Interestingly, 75 (78.9%) seropositive dogs were allocated in this group and this datum was considered significant in univariate analysis (p=0.02). Public garbage collection was reported in three neighborhoods located in urban areas and in one neighborhood located the in a rural environment (Coxipó do Ouro), but just as a sporadic activity. In the neighborhood where garbage collection service was not a usual practice, a significant statistical difference to this variable (p = 0.02 and OR 4.53) was observed among the rural neighborhoods. Vaccines against CVL, as well as collars impregnated with insecticide, were not usual practices among dog owners for this disease control. Discussion Several epidemiological studies have been carried out on the importance of the dog as L. infantum reservoir in Brazil aiming to determine CVL prevalence in endemic and non-endemic areas (DANTAS-TORRES et al., 2006; SILVA et al., 2008; CRUZ et al., 2010; FREHSE et al., 2010). The present survey and serological analysis through IFAT detected the infection of Leishmania sp. in 95 (22.1%) of dogs in Cuiabá, where CVL was recently installed. This rate of prevalence was higher than data reported in other studies accomplished in the same municipality (MESTRE; FONTES, 2007; ALMEIDA et al., 2009), and the reason may be that there were human cases of the disease reported in the same neighborhood. According to Marzochi et al. (2009), the canine disease tends to precede human cases, which are kept high in endemic areas. The presence of about 22% of leishmaniasis seropositive dogs is an important datum for the epidemiological surveillance of Cuiabá. Studies conducted in this city have already demonstrated the expansion of the canine disease even to areas even where no human cases have been reported (ALMEIDA et al., 2009). Historically, VL originates from rural environments where epidemiological patterns facilitate the circulation of the agent. However, the urbanization of this disease is a fact observed in many Brazilian states, where control is seen as more complex (NASCIMENTO et al., 2008). The elevated prevalence determined in dogs from urban 8 neighborhoods confirms the urbanization trend of VL in Cuiabá. However, it is important to highlight that rural neighborhoods hold the highest canine infection rate, representing a risk 1.9 times higher of acquiring the disease than in urban neighborhoods. One of the visceral leishmaniasis control measures in Brazil is the elimination of seropositive dogs regardless of the clinical condition (MS, 2006). In the epidemiological context, asymptomatic dogs are also important, representing a prevalence rate of 46.3% of seropositivity for CVL in the present study. As described in other Brazilian regions, the proportion of asymptomatic infected dogs has demonstrated significant prevalence when compared to clinically symptomatic dogs (DANTAS-TORRES et al., 2006). Due to the importance of domestic dogs in the VL transmission cycle, risk factors for the occurrence of the canine infection have been widely analyzed (AMORA et al., 2006; RONDON et al., 2008). Variables such as gender, age, race and fur type evaluated in the present study were not associated to the risk of acquiring the infection. This was also observed in other endemic areas (RONDON et al., 2008; SANTOS et al., 2010), although some studies present conflicting results as to the gender, age and race variables (OLIVEIRA et al., 2010; SANTOS et al., 2010). In this matter, there are no diagnostic tests for CVL that present 100% specificity and sensibility. The accuracy indices of these tests may vary as a function of the group studied and the criteria adopted to establish positive and negative gold standards (LUCEY; WEINA, 2008). Results of the IFAT - which is a serological method indicated by the Brazilian Ministry of Health (MS, 2006) to confirm CVL - were used in this study. Despite the fact that, theoretically, any dog can develop the infection, a bimodal distribution of the canine infection has been described (DANTAS-TORRES et al., 2006), with peak of cases in dogs under three years of age and dogs between eight and ten years old, in accordance with observations of this study, where dogs under three years old were the most affected by the infection. According to Santos et al. (2010), the local environment and risk factors may vary from one region to another, highlighting the mode of life of animals as one of the most important aspects to acquire CVL infection. In the present study, the statistical univariate analysis showed that guard role, free access to the street and living around the exterior of the house were factors associated to dog infection with risks 1.78, 1.89, 3.19 times higher for acquiring the disease, respectively. Such characteristics expose the 9 animals to a bigger contact with the vector and, consequently, to the infection (AMORA et al., 2006; RONDON et al., 2008). Environments degraded by disordered occupation have been described as another risk factor that facilitates the occurrence of CVL (MISSAWA; BORBA, 2009; MARZOCHI et al., 2009). The highest indexes of IFAT seropositive animals were observed in the neighborhoods located in rural environments and in the Jardim União neighborhood, which presented severe natural ecotope changes and where human cases of the disease were reported (personal communication). The Jardim União neighborhood is located next to a forest region; however, this variable was not considered as a risk factor for CVL in this study. In addition, the occurrence of the disease in men was statistically associated with cases where the dogs remained inside the home (GAVGANI et al., 2002; BORGES et al., 2009) and the presence of livestock in the property; such relation was not found here, though. In contrast, the presence of agriculture crops around the household was associated to canine leishmaniasis infection with a 1.68 risk of disease occurrence. This characteristic can stimulate the establishment of sand flies in these environments (MARZOCHI; MARZOCHI, 1994). Although cases of human and canine VL were previously reported in this area (MESTRE et al., 2011), the knowledge about these cases by the owners interviewed did not indicate a protection factor, on the contrary, it doubled the chances of their dogs acquire the infection. The lack of garbage collection represented a risk factor (OR 4.53) for the occurrence of dog infection in the Barreiro Branco neighborhood when compared to Coxipó do Ouro, where such service is provided. As observed by Moreno et al. (2005), the lack of public garbage collection tends to predispose the occurrence of infection by contributing to the proliferation of the L. longipalpis. Although CVL autochthony is known in Cuiabá (ALMEIDA et al., 2010; 2011), the maintenance of high levels of seropositive dogs in areas with occurrences of the disease reinforces the importance of epidemiological surveillance, as well as the knowledge of the risk factors associated to the canine infection, as a way to clarify the gaps that may be involved in the maintenance of the transmission cycle. In this study, despite the fact that the inhabitants know about the leishmaniasis control, no measure has been adopted by the government. This study contributes to the knowledge on the aspects of canine visceral leishmaniasis in Cuiabá and indicates the need to start educational and sanitary programs in this city. 10 Acknowledgements The authors are grateful to the ‘BioManguinhos’ Institute - FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil, for providing the indirect immunofluorescence kits used in this research. This work was supported, in part, by grants from the ‘Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Mato Grosso’ and ‘Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico’ - CNPq (process nº 474894/2010-0). References Almeida ABPF, Faria RP, Pimentel MFA, Dahroug MAA, Turbino NCMR, Sousa VRF. Inquérito soroepidemiológico de leishmaniose canina em áreas endêmicas de Cuiabá, Estado de Mato Grosso. Rev Soc Bras Med Trop 2009; 42(2): 156-159. Almeida ABPF, Mendonça AJ, Sousa VRF. Prevalência e epidemiologia da leishmaniose visceral em cães e humanos, na cidade de Cuiabá, Mato Grosso, Brasil. 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Serological prevalence and risk factors associated with Canine Visceral Leishmaniasis infection according to different neighborhoods in the city of Cuiabá State of Mato Grosso. Neighborhoods Dogs (n) IFAT positive dogs OR (CI 95%) P-value* n % Rural Area Barreiro Branco 68 29 42.64 4.18 (1.59-11.31) 0.002b Coxipó do Ouro 53 08 15.09 Total Rural Area 121 37 30.6 1.91 (1.15-3.17) 0.01 a Urban Area Bela Vista 110 20 18.18 Jardim União 92 25 27.17 2.7 (1.22-6.05) 0.01c Osmar Cabral 107 13 12.14 Total Urban Area 309 58 18.8 Total 430 95 22.1 aanalysis between urban and rural areas; banalysis between the neighborhoods Barreiro Branco and Coxipo do Ouro; canalysis between the neighborhoods Jardim União and Osmar Cabral; OR- Odds Ratio; * chi-square with Yate’s correction and Fisher’s exact test Table 2. Univariate analyses for variables considered for the study of risk factors associated with Canine Visceral Leishmaniasis in 430 dogs from Cuiabá, State of Mato Grosso, Brazil Variables IFAT positive dogs (n=95) IFAT negative dogs (n=335) OR (CI 95%) P- value* n % n % Gender Male 56 58.9 175 52.2 0.76 (0.44-1.20) 0.29 Female 39 41.1 160 47.8 Age groups 15 ≤ 1 11 11.6 52 15.5 0.41 ≥ 1 – 3 33 34.7 131 39.1 ≥ 3 – 6 32 33.7 82 24.5 ≥ 6 15 15.8 50 14.9 Indefinite age 04 4.2 20 6.0 Breed SRD 81 85.3 268 80 0.69 (0.36-1.29) 0.31 CRD 14 14.7 67 20 Fur Short 79 83.2 275 82.1 0.92 (0.48-1.67) 0.92 Long 16 16.8 60 17.9 House role Guard 48 50.5 136 40.6 1.78 (1.05-3.01) 0.03a Company 33 34.7 166 49.6 Both 13 13.7 32 9.6 Hunt 1 1.1 1 0.3 Dog habitat Intradomestic 1 1.1 5 1.5 3.19 (1.06-10.80) 0.03b Peridomiciliar 90 94.7 289 86.3 Both 4 4.2 41 12.2 SRD - Without defined Race; CRD With defined Race; OR - Odds Ratio; aanalysis between function of guard and company; banalysis between peridomicile and both; Intradomestic (limited to the interior of the house); * chi-square with Yate’s correction and Fisher’s exact test Table 3. Univariate and multivariate analyses to detect risk factors associated with the IFAT positivity of Canine Visceral Leishmaniasis in dogs from Cuiabá, State of Mato Grosso, Brazil Variables Dogs Univariate Analysis* Multivariate Analysis** Total Positive (%) P OR (CI95%) P OR (CI95%) Vegetation Yes 358 82(86.3) 0.45 1.34 16 No 72 13(13.7) (0.77-2.82) Access to the street Yes 292 74(77.9) 0.02 1.89 (1.10-3.32) 0.78 No 138 21(22.1) Domestic animals Yes 340 78(82.1) 0.49 1.27 (0.75-2.46) No 90 17(17.9) Trees in the yard Yes 194 54(56.8) 0.01 1.83 (1.13-2.98) 0.02 1.68 (1.05-2.69) No 236 41(43.2) Livestock Yes 163 40(42.1) 0.40 1.25 (0.79-1.99) No 267 55(57.9) LVH neighborhood* Yes 47 14(14.7) 0.24 1.58 (0.75-2.90) No 383 81(85.3) LVC neighborhood * Yes 56 22(23.2) 0.002 2.66 (1.47-4.75) 0.004 2.43 (1.33-4.44) No 374 73(76.8) Vector* Yes 21 4(4.2) 0.48 0.82 (0.17-2.07) No 409 91(95.8) Know Disease* Yes 298 75 0.02 1.88 (1.09-3.24) 0.11 No 132 20 Insecticide use Yes 66 19(20) 0.20 1.53 (0.81-2.70) 0.08 No 364 76(80) *Knowledge reported by pet owner; OR - Odds Ratio; *chi-square with Yate’s correction and Fisher’s exact test; ** logistic regression model Elsevier Editorial System(tm) for Research in Veterinary Science Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Canine visceral leishmaniasis diagnosis: assessment of PCR in different biological samples Article Type: Research Paper Section/Category: Parasitology Keywords: Visceral leishmaniasis; Dog; Diagnostic molecular; Biological sample; Sectional study Corresponding Author: Ms Maria de Fatima Madeira, PhD Corresponding Author's Institution: Fundação Oswaldo Cruz First Author: Arleana do B.P.F de Almeira, MsC Order of Authors: Arleana do B.P.F de Almeira, MsC; Valeria R.F Sousa, PhD; Naiami D. Gasparetto; Givago F.R. da Silva; Fabiano B. Figueiredo, PhD; Valeria Dutra, PhD; Luciano Nakazato, PhD; Maria de Fatima Madeira, PhD Abstract: In diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CanL), the research for more sensitive and specific tools, mainly molecular methods, has been a concern, however there is still no agreement on the best biological sample to be used. The objective of the present study was to evaluate PCR as a tool for diagnosis Leishmania chagasi (syn. Leishmania infantum) employing samples of buffy coat, bone marrow, intact skin and cutaneous ulcers fragments and lymph node aspirate collected from 430 dogs and correlating the results with the its clinical status. Leishmania sp. DNA was detected in 14.6% (n=63) dogs, regardless the sample analyzed. Symptomatic animals presented greater number of positive PCR in lymph node, bone marrow and intact skin samples than asymptomatic animals. The PCR technique proved to be very useful for the detection of Leishmania chagasi DNA, mainly in lymph node samples (41; 9.6%), regardless the dog's clinical status. This result and the fact that this sample is easily collected from dogs, lymph nodes aspirates are indicated to be used in epidemiological surveys through PCR. Furthermore, our results shown that cutaneous ulcers, when present, also represent good target to be used in detecting Leishmania parasites. Suggested Reviewers: teresa Cristina Bergamo do Bonfim PhD Reserch, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro tcbb@ufrrj.br Expertise in area Reginaldo Peçanha Brazil PhD Research, Fundação Oswaldo Cruz rpbrazil@ioc.fiocruz.br Rodrigo Caldas Menezes PhD Research, Fundação Oswaldo Cruz rodrigo.menezes@ipec.fiocruz.br 1 Canine visceral leishmaniasis diagnosis: assessment of PCR in different biological 1 samples 2 3 A.B.P.F. Almeidaa,b, V.R.F. Sousab, N.D. Gasparettob, G.F.R da Silvab, F.B. 4 Figueiredoc, V. Dutrab, L. Nakazatob, M.F. Madeirad,* 5 6 a Programa de pós-graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas, Instituto de 7 Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, 21040-8 900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil 9 b Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina 10 Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Correa da 11 Costa 2367, Boa Esperança, 78060-900, Cuiabá, MT, Brazil 12 c Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses de Animais Domésticos, 13 Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 14 4365, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil 15 d Laboratório de Vigilância em Leishmanioses, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro 16 Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, 17 Brazil 18 19 * Corresponding author 20 Maria de Fatima Madeira, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro 21045-900, RJ, Brazil, Tel.: 21 +55 21 3865 9541; fax: +55 21 3865 9541, e-mail: fatima.madeira@ipec.fiocruz.br 22 23 Manuscript Click here to view linked References 2 ABSTRACT 24 In diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CanL), the research for more sensitive and 25 specific tools, mainly molecular methods, has been a concern, however there is still no 26 agreement on the best biological sample to be used. The objective of the present study 27 was to evaluate PCR as a tool for diagnosis Leishmania chagasi (syn. Leishmania 28 infantum) employing samples of buffy coat, bone marrow, intact skin and cutaneous 29 ulcers fragments and lymph node aspirate collected from 430 dogs and correlating the 30 results with the its clinical status. Leishmania sp. DNA was detected in 14.6% (n=63) 31 dogs, regardless the sample analyzed. Symptomatic animals presented greater number 32 of positive PCR in lymph node, bone marrow and intact skin samples than 33 asymptomatic animals. The PCR technique proved to be very useful for the detection of 34 Leishmania chagasi DNA, mainly in lymph node samples (41; 9.6%), regardless the 35 dog’s clinical status. This result and the fact that this sample is easily collected from 36 dogs, lymph nodes aspirates are indicated to be used in epidemiological surveys through 37 PCR. Furthermore, our results shown that cutaneous ulcers, when present, also represent 38 good target to be used in detecting Leishmania parasites. 39 40 Keywords: 41 Visceral leishmaniasis 42 Dog 43 Diagnostic molecular 44 Biological sample 45 Sectional study 46 47 48 3 1. Introduction 49 Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonosis with high prevalence in Latin American 50 countries (WHO, 2012). In the transmission cycle, the domestic dog is considered an 51 important reservoir and regardless the clinical manifestation, it is a source of infection 52 for Phlebotominae vectors (Ministério da Saúde, 2006). 53 In Brazil, VL occurs in urban and periurban areas and requires compulsory 54 notification. One of the control measures recommended is the euthanasia of dogs 55 seroreactive to Leishmania sp. (Ministério da Saúde, 2006). For this reason, it is very 56 important that the tests used for Leishmaniasis diagnosis are accurate, with high 57 sensitivity and specificity. Recently, a fast immunochromatographic test, Dual path 58 platform (DPP) began to be used in Brazil as screening test in routinely dog diagnosis 59 (Ministério da Saúde, 2011). However, the confirmation of the infection through 60 parasite and / or DNA detection becomes important, mainly in areas of overlapping of 61 different agents (Silva et al., 2011) or areas where the disease has recently installed 62 (Souza et al., 2009). Biological samples such as blood, aspirates and tissue fragments 63 from different organs can be used for parasitological research of Leishmania sp., 64 however there is still no agreement on which should be the standard sample. 65 Nevertheless, the simplicity of collecting it, with less invasiveness and the laboratory 66 method used must be considered (Saridomichelakis, 2009). We cannot fail to mention 67 that aspects such as sensitivity and specificity of the diagnostic test may vary as a 68 function of the clinical sample analyzed and the dog’s clinical status (Martinez et al., 69 2011). In this context, PCR appeared as an alternative, because it represents a gain in 70 diagnosis sensitivity and specificity, and is very useful, mainly in those cases not 71 resolved by the direct or indirect classical methods (Lachaud et al., 2002; Gomes et al., 72 2007; Moreira et al., 2007). 73 4 The aim of the present study was to evaluate PCR as a diagnosis tool for 74 Leishmania chagasi using different biological samples collected from domestic dogs 75 from CanL endemic areas 76 77 2. Materials and methods 78 2.1. Animals and Biological Samples 79 The animals evaluated in the present study were from a transversal study 80 conducted in Cuiabá city (MT) located in the Mid-Western region of Brazil, involving 81 430 dogs (Almeida et al., 2011). The dogs were clinically examined and grouped into 82 symptomatic, oligosymptomatic and asymptomatic according to Mancianti et al. (1988). 83 After obtaining informed consent from the owners, the dogs were mechanically 84 contained and subjected to sedation with ketamine (10mg/kg) associated with 85 acepromazine (0.2mg/kg). Samples of blood, bone marrow, lymph nodes aspirates and 86 tissue fragments (intact skin and cutaneous ulcers) were collected from all the animals 87 for PCR. Around 5 mL of blood were collected from each animal by cephalic or jugular 88 venipuncture and the buffy coat separated by centrifugation and the bone marrow 89 (0.5mL) through aspiration from the manubrium of the sternum and, both with 90 anticoagulants. The ganglionar aspirates were obtained from popliteal lymph nodes, 91 with Valeri cytoaspirator and placed in microtubes containing 250ul of sterile saline 92 solution. The tissue biopsies were collected after local anesthesia with 2% lidocaine and 93 the fragments were also placed in sterile microtubes. All the biological samples were 94 kept at –20ºC until the use. 95 All the procedures conducted with the animals were approved by the Ethics 96 Committee on Animal Use of the Oswaldo Cruz Foundation 97 (CEUA/FIOCRUZ/52/2009-3, protocol LW-01/10). 98 5 2.2. DNA Extraction and Polymerase Chain Reaction 99 The extraction of DNA from the samples was performed according to Gomes et 100 al. (2007). Briefly, the samples collected by puncture (buffy coat, bone marrow and 101 lymph node) and the tissue fragments (intact skin and cutaneous ulcers) were dissolved 102 in lysis buffer containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10mM EDTA; 0.5% SDS; 0.01% 103 N-laurilsarcosinate and 100 ȝgml of proteinase .. Then, they were strongly shaken in 104 vortex and incubated at 56ºC for 12-18 hours. DNA extraction was performed by the 105 phenol/chloroform/isoamyl alcohol method and precipitated by isopropanol. After 106 washing with 70% ethanol for 10 minutes at 10,000 x g, the DNA precipitate was 107 dissolved in ultra-pure water containing 20ȝg/ml of RNAse and stored at–20ºC until the 108 moment of the PCR assays. 109 Initially we used the 150 (sense) primers 5’-110 GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA-3’ and 152 (antisense) 5’ 111 (C/G)(C/G)(C/G)(A/T)CTAT(A/T)TTACACCAACCCC-3’ that amplify a product of 112 120pb of a variable region of the kDNA minicircle of the Leishmania genus (Degrave et 113 al., 1994). For the reaction 200µM of dNTP, 1µM of each primer , (10mM Tris-HCl, 114 50mM KCl, pH 8,3) buffer solution, 2.5mM MgCl2, 2.5U of Taq DNA polymerase and 115 2µl of sample DNA were used in a final volume 20µl. PCR conditions were: initial 116 denaturation at 94ºC for 4 minutes, followed by 30 cycles at 94ºC for 30 seconds, 60ºC 117 for 30 seconds, 72ºC for 30 seconds and a final extension at 72ºC for 10 minutes. 118 A second PCR assay was carried out in the samples where there was amplification 119 of Leishmania sp. DNA. This time the primers RV1- 5’-CTT TTC TGG TCC CGC 120 GGG TAG G-3’ e RV2 - 5’-CCA CCT GGC TAT TTT ACA CCA-3’ that amplify a 121 sequence of 145pb, specific of Leishmania chagasi were used (Lachaud et al. 2002). 122 The time and temperature amplification conditions were: initial denaturation at 94ºC for 123 6 4 minutes, followed by 30 cycles at 94ºC for 30 seconds, 60ºC for 30 seconds, 72ºC for 124 30 seconds and a final extension at 72ºC for 10 minutes. In all the tests, reference 125 samples of L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) 126 and L. chagasi (MHOM/BR/1974/PP75) were used in both PCR assays. 127 The product from amplification was fractionated by 2% agarose gel 128 electrophoresis, stained with ethidium bromide and visualized in a transluminator (UV-129 300nm). 130 131 2.3. Result Analysis 132 The results obtained were transferred to a database and statistically analyzed by 133 EpiInfo 3.3.2 (CDC, Atlanta, EUA) program. Differences in the frequencies of positive 134 results for each clinical sample, comparative analyses of PCR results among different 135 clinical samples, and comparisons between clinical groups were performed using the 136 chi-square test. In order to evaluate the index of agreement between PCR and 137 parasitological culture (Almeida et al., 2011), Kappa measurement (k) was used 138 according to classification proposed by Shrout (1998). 139 140 3. Results 141 From 430 evaluated dogs, samples of buffy coat and intact skin fragments were 142 collected from 100% animals, while samples of bone marrow and lymph nodes aspirate 143 were obtained from 429 (99.8%) and 427 (99.3%) animals, respectively. Twenty-two 144 (5.1%) dogs presented cutaneous ulcers, located in the ear (14), back limbs (3), scrotum 145 (2), nostrils (2), and upper lip (1). 146 Clinically, 42 (9.8%) dogs were symptomatic, presented clinical signs such as 147 severe weight loss, generalized lymphadenomegaly, splenomegaly, onychogryphosis, 148 7 dermatologic and ophthalmic disorders, while 150 (34.9%) were oligosymptomatic with 149 weight loss, lymphadenomegaly and localized alopecia as the most frequent clinical 150 signs, and 238 (55.3%) animals were considered asymptomatic. 151 Leishmania sp. DNA was detected in 63 (14.6%) dogs, regardless the sample 152 analyzed and L. chagasi DNA was confirmed in all the samples when a specific primer 153 was used. From those animals, 13 (30.9%) were symptomatic, 23 (15.3%) 154 oligosymptomatic and 27 (11.3%) asymptomatic for CanL. 155 PCR was positive in two or more samples in 17 (27%) dogs, in two samples in 20 156 (31.7%) and in just one sample in 26 (41.3%). In cases where the PCR was positive in 157 only one site, the buffy coat were positive in 9 animals, skin and lymph node in 7, bone 158 marrow in two and skin ulcer in 1 dog. 159 The lymph node (41; 9.6%) was the sample that presented higher number of 160 positive results, followed by the intact skin (27; 6.3%), bone marrow (26; 6.1%) and 161 buffy coat (20; 4.6%). Leishmania DNA was detected in 13 (59.1%) out of 22 162 cutaneous ulcers fragments collected from dogs (Table 1). 163 PCR proved to be statistically better for Leishmania DNA detection in 164 symptomatic animals when compared to oligosymptomatic (p<0.001) and asymptomatic 165 (p<0.001), with a likelihood 4.85 (2.17-11.03) and 10.43 (4.7-23.53) times greater, 166 respectively. The likelihood of Leishmania sp. DNA detection in oligosymptomatic 167 dogs was 2.15 (1.31-3.52) times greater than in asymptomatic (p=0.001). However, 168 when each sample was evaluated separately, the samples of intact skin, bone marrow 169 and lymph node were statistically better for the detection of the agent in symptomatic 170 animals when compared to asymptomatic (p=0.02; 0.01 and 0.007, respectively). 171 Although the buffy coat was the sample with higher number of positive results in 172 8 asymptomatic dogs, this sample was not statistically better in any clinical group 173 (p>0.05). 174 When we compare PCR results in the different clinical samples, we observe that 175 there was no statistical difference between asymptomatic and symptomatic dogs. 176 However the lymph node was statistically better for Leishmania DNA detection when 177 compared to buffy coat (p=0.04; OR 2.91[1.03-8.6]) in oligosymptomatic dogs. 178 From 430 dogs evaluated, in 12 (22.1%) was isolated Leishmania chagasi in 179 parasitological culture (Almeida et al., 2011), and all were positive in PCR. Such tests 180 presented a low agreement (k 0.287 [0.155-0.418]) 181 182 4. Discussion 183 The importance of the dog in VL transmission cycle is widely recognized 184 (Ministério da Saúde, 2006; Marzochi et al., 2009), concentrating efforts in research 185 diagnostic methods that can discriminate infected dogs (Fisa et al., 2001; Gomes et al., 186 2007; Moreira et al., 2007; Coura-Vital et al., 2011; Grimaldi Jr et al., 2012; Teles et al., 187 2012). In the present study, we confirmed by PCR the Leishmania infection in 14.6% 188 (n=63) dogs in Cuiabá, where previously L. chagasi had been isolated and identified in 189 dogs of the same area (Almeida et al., 2011). 190 Although little used in epidemiological surveys, the molecular techniques have 191 shown higher prevalence than obtained by serological methods (Coura-Vital et al., 192 2011). According to Oliva et al. (2006) this can be related to the sensitivity of PCR in 193 detecting infection even before the occurrence of seroconversion. In Cuiabá city, the 194 serological prevalence for CanL has varied from 3.4 to 22.1%, depending on the area 195 investigated (Almeida et al., 2009; Almeida et al., 2012). Another aspect related to the 196 use of serological tests only for diagnosis Leishmania infection in dogs, is the 197 9 possibility of cross reactions in serological tests, mainly in areas of overlapping with 198 other trypanosomatids (Vexenat et al., 1996; Alves et al., 2012). In this context, 199 Trypanosoma caninum, a species recently described in Rio de Janeiro municipality 200 (Madeira et al., 2009a) was found in 14 out of the 430 studied dogs (Almeida et al., 201 2011; Barros et al., 2012), reinforcing the importance of using more accurate diagnostic 202 methods. 203 The parasite isolation in culture is considered the gold standard in the diagnosis of 204 infection by Leishmania sp. This study found poor agreement between culture and PCR. 205 However, the detection of DNA in all dogs with parasite isolation demonstrates 206 reliability in the use of PCR as a diagnostic tool in CanL diagnosis. Variations in the 207 results obtained in PCR may occur depending on the primers used and the target DNA 208 amplified (Bastien et al., 2008). In our study we used kinetoplastid DNA sequences that 209 present large number of copies of the parasite, thus increasing the sensitivity of the test 210 (Lachaud et al., 2002; Solcá et al., 2012). Despite these possible variations, the PCR 211 does not produce false positives (Teles et al., 2012). 212 PCR has proven to be an efficient technique for detecting infection by 213 Leishmania, however doubts on the better biological sample to be used encouraged 214 many researches (Fisa et al., 2001; Manna et al., 2004; Lombardo et al., 2012; Teles et 215 al., 2012). Most of the doubts refer to the invasive collection of the biological sample, 216 considering also, in this context, the lymph node and bone marrow samples, which 217 impairs its application in epidemiological surveys (Fisa et al., 2001; Manna et al., 2004; 218 Lombardo et al., 2012). Although those samples present high sensitivity and specificity, 219 these authors point the way to obtain such samples negative. Intact skin has also proven 220 to be an excellent target for CanL diagnosis, mainly through culture (Madeira et al., 221 2009; Almeida et al., 2011). Cutaneous ulcers showed good results in the detection of 222 10 Leishmania chagasi DNA. Furthermore, cutaneous ulcer is the site of predilection of L. 223 braziliensis (Madeira et al., 2009), which makes their use important in characterizing 224 the agent involved in canine infection particularly in overlapping areas of tegumentary 225 and visceral leishmaniasis. 226 In CanL the parasites can be eliminated resulting in self-limiting infection or may 227 lodge at some sites of the animal organism, causing generalized infection, symptomatic 228 or asymptomatic, depending on animal susceptibility and duration of infection 229 (Saridomichelakis, 2009). In this sense, the biological sample used as well as the 230 diagnostic technique and the animals´ clinical status must be considered. In our study, 231 the likelihood of detecting Leishmania chagasi DNA was superior in animals 232 systemically compromised when compared to those that presented slight signals or 233 without clinical signs of infection. This result is consistent with reports from other 234 studies, showing that the clinical seriousness of the dogs helps the diagnosis, regardless 235 the technique being used (Martinez et al., 2011). 236 The asymptomatic CanL cases present more obstacles for an accurate diagnosis, 237 mainly because they constitute the clinical group with higher prevalence in VL endemic 238 areas (Marzochi et al., 2009), an aspect that was also observed in the present study. The 239 diagnosis of symptomatic cases was easier when compared to asymptomatic dogs when 240 using lymph node, bone marrow and skin samples. Despite the dogs asymptomatics 241 presented higher number of positive results in the buffy coat sample, this result was not 242 significant, although this same sample had shown good results in clinically healthy dogs 243 in other studies (Coura-Vital et al., 2011). 244 The popliteal lymph node aspirate presented a higher number of positive results 245 for L. chagasi detection when compared to the other samples analyzed. According to 246 Maia et al. (2009) the lymph nodes, together with the spleen are the preferred internal 247 11 tissues for L. chagasi multiplication. Saridomichelakis (2009) also describes that the 248 lymph nodes, together with the skin, are the first sites to be in contact with the infection 249 agent. Thus, the parasitemia in those organs, can be constant in all the clinical phases of 250 the infected dog, explaining the better performance of this samples in CanL diagnosis, 251 regardless the clinical manifestations, as also described by Teles et al. (2012). 252 In summary, the lymph node aspirate presented the best results for L. chagasi 253 DNA detection, regardless the clinical status of the dog. In addition, this sample is 254 easily collected, thus, it can be used in epidemiological surveys. Furthermore, our 255 results shown that cutaneous ulcers, when present, also represent good target to be used 256 in detecting Leishmania parasites. 257 258 Acknowledgements 259 This work was supported, in part, by grants from the Fundação de Amparo a 260 Pesquisa do estado de Mato Grosso (FAPEMAT), CNPq (process nº 474894/2010-0) 261 and Fundação de Amparo a Pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-262 26/103.223/2011). 263 264 References 265 Almeida, A.B.P.F., Faria, R.P., Pimentel, M.F.A., Dahroug, M.A.A., Turbino, 266 N.C.M.R., Sousa, V.R.F., 2009. Inquérito soroepidemiológico de leishmaniose 267 canina em áreas endêmicas de Cuiabá, Estado de Mato Grosso. 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Disease Watch Focus: Leishmaniasis. 381 http://www.who.int/tdr/publications/disease watch/leish/en/index.html. 382 383 Table 1: Parasitological culture and PCR results of the investigation of Leishmania chagasi DNA, in different biological samples obtained from 430 dogs Clinical status Positive culture# PCR Blood Lympho node Bone marrow Skin Cutaneous ulcers Total +/n Asymptomatics (n=238) 04 11 15 09 10 01 27/238 Olygosymptomatic (n=150) 04 06 16 11 11 07 23/150 Symptomatic (n=42) 04 03 10 06 06 05 13/42 Total +/n 12/430 (2.8%) 20/430 (4.6%) 41/427 (9.6%) 26/429 (6.1%) 27/430 (6.3%) 13/22 (59.1%) 63/430 (14.6%) # data published by Almeida et al. (2011) Table 1 Elsevier Editorial System(tm) for Veterinary Parasitology Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Natural infection by Trypanosoma caninum, a new parasite isolated from dogs: study of 14 cases occurred in Cuiabá, Brazil Article Type: Research Paper Keywords: Dog; Leishmania chagasi; Co- infecção; Diagnostic Corresponding Author: Mrs Maria de Fatima Madeira, Ph.D Corresponding Author's Institution: Fundação Oswaldo Cruz First Author: Maria de Fatima Madeira, Ph.D Order of Authors: Maria de Fatima Madeira, Ph.D; Arleana do B.F. de Alemeida, MSc; Juliana H. da S. Barros, MSc; Valeria Regia Franco Sousa, Ph.D; Andreia S. Alves, MSc; Luciana de F.C. Miranda, MSc; Tatiana da S. F. de Oliveira, MSc; Armando de O. Schubach, Ph.D; Mauro Celio de A. Marzochi, Ph.D Abstract: Trypanosoma caninum constitutes the most recent trypanosomatid specie described in Brazil which infects domestic dogs. In this study clinical and laboratory aspects of 14 dogs naturally infected by this parasite, which were diagnosed during a cross- sectional study on Leishmaniasis in Cuiabá (Mato Grosso, Brazil), are described. The animals were assessed at interval of 3, 6 and 12 months and the presence of the parasite and/or DNA in different biological samples have been investigated by parasitological (culture and smears exams) and molecular (DNA- based tests) methods. Specific anti- T. caninum and anti- Leishmania antibodies were also investigated. In the 14 animals studied, 10 have shown a good general state and anti- T. caninum IgG antibodies were confirmed by IFAT and ELISA in 10 and 8 animals, respectively. During the monitoring, the clinical status of the animals did not vary. Two co- infection cases by Leishmania were found and relevant clinical signs were found in one case only, due to CanL. Although intact skin, cutaneous scar, blood, bone marrow and lymph node aspirate samples were analyzed in the different intervals, T. caninum was found only in the intact skin, confirming a particular biological characteristic of this parasite, previously appointed. The results showed in this study suggest that T. caninum is not pathogenic and/or little virulent to the dogs and the infection course is asymptomatic and transitory with low humoral immune response. Additionally, this study confirm the overlapping endemic areas for T. caninum and L. chagasi in Cuiabá and broaden of the knowledge of this new parasite described in Brazil, which may be useful in control actions that involving the visceral leishmaniasis. October 20th , 2012 Dear Editor We are sending the paper untitled: “Natural infection by Trypanosoma caninum, a new parasite isolated from dogs: study of 14 cases occurred in Cuiabá, Brazil” to be peer reviewed and published in the Veterinary Parasitology. This paper is being submitted in the original format and describes aspects of the protozoon T. caninum. This parasite was recently described by our group infecting domestic dogs in Brazil and this finding has been caused some concern because the dog is the urban reservoir of L. chagasi, agent of visceral leishmaniasis. Apparently this parasite shows low pathogenicity for dogs, however little is known about this agent. During a cross-sectional study on leishmaniasis we detected 14 dogs naturally infected by this parasite, enabling the study of this trypanosomatid under certain aspects. The results are interesting and reinforce previous reports already obtained in other studies. We believe that the disclosure of these results will be important, particularly about the possibility of this phenomenon interfere in the control of visceral leishmaniasis in Brazil. The authors provide assurance the project underwent ethical review and was given approve by the Ethics Committee on Animal Research of the Oswaldo Cruz Foundation (CEUA/FIOCRUZ) We hereby declare that all data contained are accurate, all authors have participated in the work in a substantive way and are in agreement with its content. The manuscript being submitted to this Journal has not been published and is not being submitted for publication elsewhere. Thanks a lot, Maria de Fatima Madeira Adress: Fundação Oswaldo Cruz - Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas - Laboratório de de Vigilância em Leishmaniose, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro 2 1045- 900, RJ, Brazil e- mail adress: fatima.madeira@ipec.fiocruz.br Cover Letter 1 Natural infection by T ry panosoma caninum , a new parasite isolated from dogs: study of 1 14 cases occurred in Cuiabá , Brazil 2 3 Maria de Fatima Madeira a,* , Arleana do B .P.F . de Almeidab , Juliana H .S. Barrosa , 4 Valéria R .F . Sousab , Andreia S . Alvesa , Luciana de F .C. Miranda a , Tatiana da S .F . de 5 Oliveiraa , Armando de O . Schubacha , Mauro Célio de A . Marzochi a 6 7 a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Instituto de Pe squisa Clínica Evandro Chagas 8 (I PEC), Laboratório de Vigilância em Leishmaniose, Av. Brasil 4365, Rio de Jan eiro 9 21045- 900, RJ, Brazil 10 b Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), Departamento de Clínica Médica 11 Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Av. Fernando 12 Correa da Costa S/N, Boa Esperança, Cuiabá , 78060- 900, MT, Brazil 13 14 15 * Corres ponding author 16 Maria de Fatima Madeira, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro 21045 - 900, RJ, Brazil, Tel.: 17 +55 21 3865 9541; fax: +55 21 3865 9541, e- mail: fatima.madeira@ipec.fiocruz.br 18 19 20 Manuscript Click here to view linked References 2 Abstract 21 T rypanosoma caninum constitutes the most recent trypanosomatid specie described in 22 Brazil which infects domestic dogs. In this study clinical and laboratory aspects of 14 23 dogs naturally infected by this parasite, which were diagnosed during a cross - sectional 24 study on Leishmaniasis in Cuiabá (Mato Grosso, Brazil), are described. The animals 25 were assessed at interval of 3, 6 and 12 months and the presence of the parasite and/or 26 DNA in different biological samples have been investigated by parasitological (culture 27 and smears exam s) and molecular (DNA- based tests) methods. Specific anti- T . caninum 28 and anti- Leishmania antibodies were also investigated. In the 14 animals studie d, 10 29 have shown a good general state and anti- T . caninum IgG antibodies were confirmed by 30 IFAT and ELISA in 10 and 8 animals, respectively. During the monitoring, the clinical 31 status of the animals did not vary. Two co- infection cases by Leishmania were found 32 and relevant clinical signs were found in one case only, due to CanL. Although intact 33 skin, cutaneous scar, blood, bone marrow and lymph node aspirate samples were 34 analyzed in the different intervals, T . caninum was found only in the intact skin, 35 confirming a particular biological characteristic of this parasite, previously appointed. 36 The results showed in this study suggest that T . caninum is not pathogenic and/or little 37 virulent to the dogs and the infection course is asymptomatic and transitory with low 38 humoral immune response. Additionally, this study confirm the overlapping endemic 39 areas for T . caninum and L. chagasi in Cuiabá and broaden of the knowledge of this 40 new parasite described in Brazil, which may be useful in control actions that involving 41 the visceral leishmaniasis. 42 43 Keywords : Dog , Leishmania chagasi , Co - infecção, Diagn ostic 44 45 3 1. Introduction 46 T rypanosoma caninum is a parasite firstly described in Rio de Janeiro state (Madeira 47 et al., 2009; Pinto et al ., 2010) and later in other states in Brazil (Barros et al., 2012). 48 Although it is a recently recognized species, 53 cases of the natural infection in dogs 49 have already been registered in areas where canine visceral leishmaniasis (CanL) is 50 endemic. Aspects related to the pathogenesis of this parasite for dogs or the possible 51 involvement of other vertebrate and/or invertebrate hosts in the transmission cycle are 52 still unknown. Information collected so far show that T . caninum is a species with 53 particular biological characteristics, being isolated exclusively from intact skin 54 fragments, unusual feature for T rypanosoma genus representatives; it does not infect 55 triatomine insects and grows very well in axenic cultures, with predominance of 56 epimastigote forms (Madeira et al ., 2009). Molecular analysis of partial SSU ribosomal 57 DNA sequences have shown that all isolated from T . caninum described so far are 58 genetically identical or closely similar (Barros et al., 2012). Apparently, this parasite 59 seems to be little immunogenic for dogs, even though it is able to stimulate the 60 production of specific antibodies (Alves et al., 2012). 61 In Brazil, vis ceral leishmaniasis (VL) is endemic in many regions and the dog is the 62 main domestic reservoir, playing an important role in the epidemiological cycle, thus 63 constituting one targets in the control actions (Ministério da Saúde, 2006). The 64 phenomenon of T . c aninum to parasitize domestic dogs in overlapping areas with VL is 65 a theme currently in evidence, mainly for the possible interference in the VL control 66 actions that are carried out in Brazil 67 The finding of 14 dogs naturally infected by T . caninum (Almeida et al., 2011) 68 during a cross- sectional study on Leishmaniasis done in Cuiabá city, Mato Grosso state, 69 4 located in the Midwest of Brazil, enabled the study of aspects related to the natural 70 infection by this parasite. 71 72 2. Materials and methods 73 2.1 Animals a nd collection of biological samples 74 Fourteen dogs naturally infected by T . caninum were studied. The animals were 75 identified during the cross- sectional survey for CanL done in Cuiabá city, Mato Grosso, 76 in 2009 (Almeida et al., 2011). The diagnosis of the i nfection has been established by 77 parasitic isolation and posterior identification by PCR (18S rDNA) and sequencing 78 (Barros et al., 2012). In this occasion the animals were submitted to sedation with 79 Ketamine (10 mg/Kg) associated with Acepromazine (0.2 mg/ Kg) for the physical 80 examination and collection of biological samples following Ethics Committee on the 81 Use of Animals , approved by Oswaldo Cruz Foundation ( CEUA license number LW -82 01/10). The physical examination has been directed to clinical signs compati ble with 83 CanL (e.g weight loss, lymphadenopathy, conjunctivitis, alopecia, splenomegaly and 84 presence of ulcers or cutaneous scars). After the physical examination, the collection of 85 the following biological samples was done: 86 a) Blood: it was obtained from the jugular vein (~10 mL) with scalp and put into two 87 tubes, one for obt aining serum used in serological tests and the other one containing 88 anticoagulant (EDTA) for culture and molecular assays. At this moment, part this 89 material was smeared onto slides for the cytological exam. 90 b) Bone marrow: about 0.5- 1.0 mL has been collected from the sternum and put into a 91 tube containing anticoagulant (EDTA ) and processed as the blood described 92 previously. Slides with bone marrow smears have also been done. 93 5 c) Lymph node: this material has been obtained by the puncture of the most enlarged 94 popliteal lymph node with the use of Valery aspirator. From the punctured material 95 (about 0.1- 0.3 mL), 2 slides with smears were done and part was reserved for 96 molecular analysis. 97 d) Intact skin and cutaneous scar: intact skin fragments have been collected from the 98 scapular region with a 3- mm punch after trichotomy, antisepsis and local anaesthesia 99 with lidocaine 2%. Two fragments have been put in physiological solution for culture 100 and a fragment has been stored at - 20ºC for molecular tests. Cutaneous scar 101 fragments have been processed the same way of the skin. 102 The monitoring of the animals was done 3, 6 and 12 months after the initial 103 diagnosis, in order to evaluate the clinical course of the infection by T . caninum and 104 research its presence and/or DNA in biological samples collected in these intervals by 105 parasitological and molecular tools. 106 107 2 .2 . Laboratory investigations 108 2.2.1 Serological tests 109 Anti- T .caninum and anti- Leishmania sp. IgG antibod ies were assessed in serum of 110 all animals by indirect fluorescence antibody test (IFAT), immunoenzimatic assay 111 (ELISA) and immunochromatographic test DPP® (Dual Path Platform). 112 Anti- T . caninum IgG antibodies have been researched using in house tests (IFAT 113 and ELISA) with homologue antigens following protocols according to Alves et al., 114 (2012). For the tests to detect anti - Leishmania IgG antibodies, IFAT (IFI - leishmaniose 115 visceral canina), ELISA ( EIE - leishmaniose visceral canina) and the 116 immunochromatographic rapid test (DPP®) kits have been used. These commercial 117 tests are manufactured by Bio- M anguinhos/FIOCR UZ/MS and distributed to public 118 6 service for CanL diagnosis in Brazil (Ministério da Saúde, 2006; Grimaldi et al., 2012). 119 The procedure with the kits followed the manufacturer’s instructions. 120 121 2.2.2 Parasitological diagnosis: culture procedure and smear examinations 122 For culture , intact skin and scar fragments, blood and bone marrow have been 123 processed. Tissue fragments were initially immersed in saline solutions containing 124 1,000 U penicillin, 200 µg streptomycin, and 50 µg 5' fluorocytosine per milliliter, and 125 stored at 4oC for 24 h. Thereafter, each fragment was seeded into screw cap tubes 126 containing blood- agar slants (NNN - Novy, MacNeal and Nicolle ) overlaid with 1.5 ml 127 of Schneider's Drosophila Medium (Sigma) supplemented with 10% fetal calf serum 128 (FCS). The blood and bone marrow (~0.2 - 0.3 mL) were seeded immediately after the 129 collection in tubes containing the same culture medium. All cultures were duplicated, 130 processed and kept at 27ºC ( (± 0.4 oC) and weekly examined under optical microscopy 131 for 40- 50 days. The isolated parasites were identified by isoenzyme electrophoresis 132 technique (promastigote forms) or by PCR assay (epimastigote forms) as described by 133 Almeida et al., (2011) and Barros et al., (2012), respectively. 134 The smears of blood, bone marrow and lymph node aspirates were fixed in methyl 135 alcohol and later stained by Giemsa. The slides were examined through optical 136 microscopy scanning at least 2,000 microscopic fields (x1000) looking for the presence 137 of any parasite. 138 139 2.2.3 Molecular assays 140 The blood, bon e marrow and tissue (intact skin and scar fragments) samples have 141 been processed for three different PCR assays. Initially, t he DNA of all samples was 142 7 extracted in accordance with phenol- chloroform method (Gomes et al., 2007). After this 143 procedure, the DNA were stored in a freezer at - 20ºC until PCR assays. 144 a) DNA detection with targets directed to 18S region (rDNA): the nested- PCR 145 protocol described by Smith et al., (2008) has been used, and the same test has been 146 used to identify T. caninum isolates (Barros et al., 2012). E xternal primers TRY927F 147 (5’ *AAACAA*AAACAC***A* 3’) and T5Y275 (5’ 148 CTACT***CA*CTT**A 3’) have been used applied for the first round and internal 149 primers SSU561F (5’ T***ATAACAAA**A*CA 3’) and SSU5615 (5’ 150 CT*A*ACT*TAACCTCAAA*C 3’) for the second round. Each PCR run included 151 positive controls as Trypanosoma caninum DNA (MCAN/BR/2003/A27) and 152 Leishmania chagasi DNA (M HOM/BR/1974/PP75 ). 153 b) DNA detection with targets directed to kDNA- minicircle: protocols described by 154 Degrave et al., (1994) have been used with primers  5’- (G/C) (G/C) (C/G) 155 CC(A/C)CTAT(A/T)TTACACAACCCC- 3’ and 5’ - GGG GAGGGGCGTTCTGCGAA - 156 3’. As positive control, Leishmania chagasi DNA (MHOM/BR/1974/PP75) has been 157 used. 158 c) DNA detection of constitutive gene ( - globin): this assay was used as internal 159 control of PCR reactions, in order to confirm the absence of the inhibition factors. The 160 primers 5’ CAA CTT CAT CCA C*T TCA CC 3’ and 5’ ACA CAA CT* T*T TCA 161 CTA *C 3’ were used, which amplify a product of 118bp, following the protocol 162 according to Quaresma et al., (2009). 163 All PCR products were run on a 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide , 164 and visualized under UV light . 165 166 167 8 3. Results 168 3.1 A nimals 169 Among 420 dogs examined in the serological survey for CanL, 14 (3.25%) infected 170 by T . caninum were included in this study. Among these 14 dogs, 11 were male, 12 had 171 non- defined breed and the age ranged between 8 months and 8 years (median = 2 172 years). All animals showed peridomiciliar habits and the free access to street was 173 registered in 10 cases. At the moment of the initial diagnosis, 10 dogs showed a good 174 general state and four showed 1 or 2 clinical signs compatible with CanL, suc h as: 175 weight loss (2), lymphadenomegaly (1), splenomegaly (2). One animal (nº 799) showed 176 cutaneous scar in the scrotum. The monitoring 3, 6 and 12 months after the T . caninum 177 infection diagnosis was done in 8, 3 and 1 dogs, respectively. The other dogs could not 178 be found or were taken to other regions. Only one dog (nº 732) had its clinical status 179 changed at 6 months when it showed lymphadenopathy, splenomegaly, conjunctivitis 180 and hair loss, compatible with clinical signs of CanL. 181 182 3.2 Serological tests 183 At the moment of the initial diagnosis, anti T . caninum antibodies were detected in 184 10 animals by IFAT, with titles varying from 1:40 to 1:640 and in 8 by ELISA. 185 Employing the specific kits for CanL diagnosis, 2 animals (nº 732 and 799) were 186 seroreactors to IFAT , respectively with titles of 1:40 and 1:80. With EIE all animals 187 were negative and with DPP only the animal nº 732 showed a positive result. 188 189 3.3 Parasitological tests 190 T . caninum was isolated from the skin of the 14 animals evaluated in this study. The 191 cutaneous scar (only dog nº 799) , blood and b one marrow cultures processed in this 192 9 same occasion were negative for the presence of this parasite in all cases. Three months 193 after, T . caninum was reisolated from skin fragments of the all 8 dogs reexamined. The 194 attempt to reisolate T . caninum from the skin at 6 months (3 cases) and 12 months (1 195 case) did not succeed. Blood and bone marrow samples collected for the culture at 3, 6 196 and 12 months, respectively in 3, 3 and 1 animal were negative, except in one case 197 where L. chagasi was isolated from the dog nº 732 in bone marrow at 6 months. 198 The smear examinations of the blood, bone marrow and lymph node samples 199 collected in the initial diagnosis and during monitoring were negative, except the dog nº 200 732, from which amas tigote forms were viewed in the bone marrow sample collected 201 after 6 months. 202 203 3.4 Molecular assays 204 Nested- PCR tests (18S rDNA) done with skin fragments of the 14 dogs, collected 205 at the moment of the initial diagnosis, showed positive results with amplification 206 products similar to T . caninum in 12 cases, having two animals (nº 604 and 732) shown 207 negative results. The blood, bone marrow and lymph node samples were negative for T . 208 caninum amplification pattern in all cases. However, one animal (nº 732) showed an 209 amplification product similar to L. chagasi for the bone marrow sample. When these 210 samples were analyzed for the research of Leishmania specific DNA, only the bone 211 marrow sample of animal nº 732 was positive. 212 In the monitoring done 3 months later, the skin fragments collected from 8 dogs, 4 213 showed PCR positive for T . caninum (nº 527, 798, 799 e 808), whereas the research of 214 Leishmania DNA was negative in all 8 cases. The research of T . caninum and 215 Leishmania DNA was negative for blood, bone marrow and lymph node samples of 3 216 dogs examined in this interval . After 6 months T . caninum DNA was not detected in 217 10 skin, blood, bone marrow and lymph node samples of 3 animals reevaluated. 218 Nevertheless, a pattern of amplification similar to L. chagasi was detected in bone 219 marrow and lymph node samples of the animal nº 732 and in the cutaneous scar and 220 lymph node samples of the animal nº 799. By PCR specific assay, Leishmania DNA 221 was found in these samples, having the others samples shown negative results. After 12 222 months the only animal (nº 604) reevaluated showed neg ative results for both PCR 223 assays for all samples analyzed. 224 In the PCR assay for  - globin, all samples were positive, showing an amplification 225 product of about 118 bp. 226 The all results obtained can be found in Table 1. The pattern of amplification of T. 227 caninum and Leishmania by PCR assays can be observed in the Figure 1 . 228 229 Discussion 230 T . caninum is a recent parasite described and its accurate diagnosis is still a 231 challenge. In all cases reported so far, T . cani num infection has been established from 232 the culture of dog skin fragments, however, in all these occasions, the aim was the CanL 233 diagnosis (Madeira et al., 2009; Pinto et al., 2010; Silva et al., 2011; Almeida et al, 234 2011). Although the culture has not been normally applied in canine surveys, a 235 prevalence of 3.19% and 5.23% of T . caninum infection has been described in two areas 236 of Rio de Janeiro (Pinto et al., 2010). Using the same technique in Cuiabá city, Almeida 237 et al., (2011) have found a prevalence of 3.25%. This data suggest that the prevalence of 238 T . caninum may be low or that such rates are influenced by other reasons. In fact, both 239 the technique and the biological sample analyzed interfere on the sensitivity and 240 specificity of the diagnostic test, a nd consequently on the infection prevalence rates 241 (Morales - Yuste et al., 2012). 242 11 In the 14 animals analyzed in this study, 71% showed a good general stat e, even 243 during the monitoring. Relevant clinical signs have been found in only one case co-244 infected by L. chagasi and then attributed to CanL. The results obtained here associated 245 to previous observations make it possible to suggest that the infection by T . caninum 246 may course without specific clinical signs and be transitory or could course with low 247 parasitemia making the detection difficult by the methods used up to the moment. 248 It is curious to mention that the first case of the infection by T . caninum was in one 249 dog co- infected by L. braziliensis in Rio de Janeiro (Madeira et al., 2009) and we now 250 report the co- infection by T . caninum and L. chagasi , confirming the overlapping 251 endemic areas for both agents in Cuiabá city . 252 The lack of knowledge about the biological cycle of T . caninum restricts the choice 253 of biological samples to be analyzed and of more appro priate tools for its diagnosis. 254 Considering the limitation of the culture sensitivity, and the PCR results ob tained in this 255 study, we showed, once more, the particularity of T . caninum to be found exclusively in 256 intact skin (Madeira et al., 2009; Pinto et al., 2010; Silva et al., 2011). Interesting 257 finding was to note that PCR showed negative results for T . caninum DNA in skin 258 fragments of two dogs, whose culture was positive in the same occasion. Although it 259 has already been observed in CanL (Figueiredo et al., 2010), it can be partially 260 explained also by not k nowing of the evolutive form of T . caninum in this site. 261 Furthermore, there is evidence that inhibitors an interfering role during PCR assays, and 262 the use of the internal control in this work was important to increase the confidence in 263 our results. 264 T . caninum is a parasite yet little studied and species- specific molecular targets are 265 not available. Here, t he use of targets for the region of the ribosomal gene (18S rDNA), 266 despite being general, was enabled to detect Leishmania DNA in two dogs, whose result 267 12 was confirmed by other tests. This finding shows that the combination of methods may 268 be useful when the agents are rarely studied, such as T . caninum and confirmed two co-269 infection cases. 270 The humoral immune response in the infection by T . caninum has been low or 271 absent (Alves et al., 2012) and ours results corroborate this observation, showing that of 272 14 dogs naturally infected by this parasite, 43% were seronegative, even applying 273 homolog antigen in the tests. This date can be correlated to the characteristic of T . 274 caninum, whose presence seems to be limited and restricted to skin. Unlike, i n CanL the 275 presence of L. chagasi in different organs and tissues is had as one of the responsible 276 factors responsible for the high humoral immune response (Martinez et al., 2011). The 277 low humoral response observed in the T . caninum infection may, on one hand, limit the 278 variety of options for its diagnosis, but, on the other hand, is a positive issue, 279 considering that serology constitutes the recommendation for CanL diagnosis in Brazil 280 (Ministério da Saúde, 2006) . Among the dogs studied only the animals co- infected by 281 Leishmania have reacted to specific tests for CanL. 282 The monitoring of dogs in endemic areas is a hard task. Dogs are animals that are 283 usually taken from one area to another, which constitutes one of the reasons for the 284 geographic expansion of some zoonosis that have the dog as a dispersion element 285 (Baneth et al., 2008; Colwell et al., 2011), for instance, the visceral leishmaniosis 286 (Marzochi et al., 2009). Although T . caninum is apparently not pathogenic to dogs, it 287 may represent more one agent in this complicated context (Barros et al., 2012) . Thus, it 288 is important that the infection dynamics in this host be particularly known about the 289 possibility of this phenomenon interfering in the control of visceral leishmaniasis in 290 Brazil. 291 292 13 Conflict of interest 293 The authors have no conflict of interest 294 295 Acknowledgments 296 This study was funded in part by grants from Conselho Nacional de 297 Desenvolvimento Científico (CNPq, process nº 474894/2010 - 0), Fundação de Amparo a 298 Pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, 26102321 - 2009/bolsa) and the 299 Fundação de Amparo a Pesquisa do estado de Mato Grosso (FAPEMAT ). M.C.A. 300 Marzoc hi and A. Schubach are the recipients of fellowships from CNPq. 301 302 14 References 303 Almeida, A.B.F ., Sousa, V .R., Boa- Sorte, E .C., Figueiredo , F .B., de Paula, D.A., 304 Pimentel, M .F ., Dutra, V ., Madeira , M .F ., 2011. Use of parasitological culture to 305 detect Leishmania (Leishmania) chagasi in naturally infected dogs. 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Agarose gel electrophoresis showing the amplified products with representative 368 samples of the study. A: PCR assay that targeted a partial sequence of the 18Sr DNA 369 gene. Lane 1: DNA ladder 100pb; L ane 2: DNA control of T rypanosoma caninum 370 (MCAN/BR/2003/A27) ; L ane 3- 5: skin samples of dogs 527, 531 and 534; Lane 6: 371 bone marrow sample of dog 732; L ane 7: cutaneous scar sample of dog 799; Lane 8: 372 lymph node sample of dog 799; Lane 9: DNA control of Leishmania chagasi 373 (MHOM/BR/1974/PP75 ); Lane 10: negative control. B: PCR assay that the conserved 374 region of Leishmania kDNA minicircles. Lane 1: DNA ladder 100pb; Lane 2: DNA 375 control of Leishmania chagasi (MHOM/BR/1974/PP75); Lane 3: bone marrow sample 376 of dog 732; Lane 4: lymph node sample of dog 732; Lane 5: cutaneous scar sample of 377 dog 799; Lan e 6: lymph node sample of dog 799; Lanes 7 - 9: skin samples of dogs 527, 378 531 and 534; Lane 10: negative control. 379 380 Table1 Results obtained from parasitological (culture and smears exams) and molecular (18S rDNA and Leishmania-kDNA) assays performed with different biological samples obtained from 14 dogs naturally infected by Trypanosoma caninum. Dog Nº Parasitological tests Molecular assays - PCR culture Smears exams 18S rDNA Leishmania-KDNA blood bone marrow skin blood bone marrow Lymph node blood bone marrow skin Lymph node blood bone marrow skin Lymph node 527* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 527a nd nd + (Tc) nd nd nd nd nd + (Tc) nd nd nd - nd 531* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 531a nd nd + (Tc) nd nd nd nd nd - nd nd nd - nd 534* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 534a nd nd + (Tc) nd nd nd nd nd - nd nd nd - nd 576* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 577* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 604* - - + (Tc) - - - - - - - - - - - 604c - - - - - - - - - - - - - - 627* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 669* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 669a nd nd + (Tc) nd nd nd nd nd - nd nd nd - nd 732* - - + (Tc) - - - - + (Lc) - - - + (Lc) - - 732b - + (Lc) - - + - - + (Lc) - + (Lc) - + (Lc) - + (Lc) 769* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 769a nd nd + (Tc) nd nd nd nd nd - nd nd nd - nd Table 784* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 798* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 798a - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 798b - - - - - - - - - - - - - - 799* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 799a - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 799b - - - - - - - - - + (Lc) - - - + (Lc) 808* - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - 808a - - + (Tc) - - - - - + (Tc) - - - - - * Biological samples collected at the same occasion of the initial diagnosis; a Biological samples collected after 3 months; b Biological samples collected after 6 months after ; c Biological samples collected after 12 months; Tc (Trypanosoma caninum), Lc (Leishmania chagasi), (-) negative results, (+) positive results; nd (not done) Figure Click here to download high resolution image 1. Graduate Program in Clinical Research in Infectious Diseases, IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 2. Veterinary Medical Clinic Department, UFMT, Cuiabá, MT, Br azil. 3. Surveillance Laboratory for Leishmaniasis, IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brazil Correspondence to: Valéria Régia Franco Sousa. Hospital Veterinário da UFMT. Avenida Fernando Correa da Costa nº2367, 78060 - 900, Bairro Boa Esperança, Cuiabá, MT. Tel: +5565 3615- 8662 R.205. E - mail: regia@ufmt.br NATURAL INFECTION BY Trypanosoma cruzi IN ONE DOG IN CENTRAL WESTERN BRAZIL – A CASE REPORT Arleana do Bom Parto Ferreira de ALMEIDA (1,2) , Daphine Ariadne Jesus de PAULA (2), Maria Luisa Paro OTTON(2), Felipe Wolf JAUNE (2), Raquel Aparecida Sales da CRUZ (2), Maria de Fátima MADEIRA (3), Luciano NAKAZATO (2), Adriane Jorge MENDONÇA (2), Caroline Argenta PESCADOR (2) & Valéria Régia Franco SOUSA (2) SUMMARY It is estimated that about 10 million people are infected with Trypanosoma cruzi worldwide, mostly in America Latina and more than 25 million are at risk of acquiring this infection in endemic areas. Dogs are an important reservoir for this pathogen and thus, considered a risk factor for human populations. This report describes one case of Chagas disease in a dog from Cuiabá , Mato Grosso State, Brazil . The diagnosis was obtained by direct examination of trypomastigotes cells, DNA amplification by Polymerase Chain Reaction, and sequencing. The animal presented multisystemic signs and died. Although acute Chagas disease in human is not described in Cuiabá, this is the first report of a canine case in this region. This case represents a warning, to health professionals and authorities, to the possibility of transmission of this zoonosis in Cuiabá. KEYWORDS: Chagas disease; Trypanosoma cruzi ; dog; acute infection; Cuiabá 2 RESUMO Trypanosoma cruzi , infecta cerca de 10 milhões de pessoas , principalmente na América Latina e mais de 25 milhões apresentam - se em risco de adquirir a doença nas áreas endêmicas. Os cães são considerados importantes reservatórios representando fator de risco para a população humana. Este relato descreve um caso de doença de Chagas em um cão na cidade de Cuiabá. O diagnóstico foi feito a partir do exame direto, apresentando inúmeras formas tri pomastigotas, cuja etiologia foi confirmada através do sequenciamento de produt os amplificados pela PCR. O animal apresentou sinais multissistêmicos, evoluindo para óbito. Apesar da doença de Chagas aguda em humanos não ser descrita em Cuiabá, este é o pri meiro relato de um caso canino nessa região, fato que, constitui um alerta aos profissionais da saúde e autoridades sanitárias para a possibilidade da transmissão desta zoonose em Cuiabá. PALAVRAS CHAVE: doença de Chagas; Trypanosoma cruzi , cão; infecção aguda; Cuiabá INTRODUCTION It is estimated that 10 million people are infected worldwide, by the protozoan Trypanosoma cruzi , the etiologic al agent of Chagas disease. Chagas disease is endemic in Latin America where more than 25 million people are at risk of acquiring this disease21. Chagas disease can be transmitted through excretion from infected insect vectors, blood transfusion, organ transplants, oral transmission, and laboratory accidents8. Four cases of human T. cruzi acute infection have been reported in the state of Mato Grosso – Midwest Brazilian so far and only infected vectors are found in Cuiabá where no notification of human or canine cases have been described15. 3 Dogs are considered an important parasite reservoir in the domestic cycle, and because their proximity to human beings, th ey represent a risk factor for the human population6,11 . Clinically infected dogs can develop both the acute and chronic phases of the disease, similar to the human forms; dogs are indicated as the experimental mod el for chagasic infection in humans4,7 . Dogs frequently present nonspecific clinical signs in the acute phase of this disease; however, the chronic phase is characterized by alterations indicative of dilated cardiomyopathy and right cardiac insufficiency, observed in electrocardiographic (EKG) and echocardiographic (ECG) examinations 14. According to Bahia et al.3 and González - Vieyra et al. 10 , this clinical presentation is highly variable and depends on the type of strain involved in the infection, route of infection, and parasite burden. The diagnosis is based on serology, direct or indirect parasitological tests, and molecular tests2. The present report describes the clinical and pathological analyses of a dog naturally infected with T. cruzi in Cuiabá , Mat o Grosso, Brazil. CASE REPORT A Brazilian Mastiff female dog, at five years old, from a farm located in the outskirts of Cuiabá , Mato Grosso, was brought to the Veterinary Hospital with a history of hind limbs paresis progressing to quadr iparesis for about three days, apathy, and suspected pregnancy. The physical examination indicated normal physiological parameters, abdominal distension, limbs edema, and generalized flaccid paralysis. The ultrasonography showed three viable fetuses at 47 days of age; the chest radiography showed a bilateral ventricular cardiac enlargement. The hematological 4 results included hypochromic normocytic anemia, leukocytosis, neutrophilia, lymphopenia, and the presence of trypomastigote forms of Trypanosoma sp.. The biochemical tests showed renal profile and alanine aminotransferase within the normal range, increased serum activities of aspartate aminotransferase, and decreased albumin and globulin. Bilirubinuria, occult blood, le ukocytes, bilirubin crystals, rare squamous epithelial cells, acidic pH , and normal density were observed in the urinalysis. The analysis of blood samples in light microscopy showed high amounts of flagellar structures consistent with Trypanosoma ; blood aliquot s were separated and stored at - 20 ° C for DNA extraction and subsequent polymerase chain reaction (PCR). The cytology of the bone marrow (sternum) and popliteal lymph node revealed the presence of amastigotes forms. The treatment was established on the second day with diminazene diaceturate at 3.5 mg/kg/day, fluid, and multivitamin support. On the third day worsen clinical signals were observed including hypothermia, anasarca, anorexia, abdominal contractions, vaginal discharge, and vocalization. A second round of hematological analysis and abdominal ultrasonography were performed and revealed increased leukocytosis with neutrophilia, thrombocytopenia, reactive lymphocytes, monocy te, f ewer trypomastigotes, and nonviable fetuses. The animal died on the fourth day after presenting dementia, cardiac arrest, and abortion of the fetuses. M ild hydrothorax and hydropericardium were the main postmortem findings characterized at necropsy. The heart was enlarged and remarkably globoid, with multiple white bands and foci on the epicardium and myocardium , especial ly in the right ventricle. The right heart chamber was also dilated. Hepatic and pulmonary congestions and enlarged lymph nodes were also observed. The lesions were 5 microscopically characterized by severe multizonal lymphohistiocytic cellular infiltrates in the myocardium interstice and amastigotes nests surrounded by mononuclear cells (Fig. 1) . Additionally, multifocal non- suppurative meningoencephalitis, characterized by lymphocytic cellular infiltrates and moderate mononuclear perivasculitis with pseudocysts in the cerebral cortex, cerebellum, and brain stem, were identified. Other findings included sinusoids hepatic congestion of the central vein, mild mononuclear hepatitis, vacuolization of hepatocytes, severe spleen congestion , and diffuse lymph nodes hyperplasia. No macroscopic or microscopic lesions were found in the digestive tract. Parasitization was observed in examined sections of the liver, lymph nodes, and kidneys. Chagas disease was confirmed by nested PCR on the 18S rDNA region19 , and sequenci ng of the amplified products revealed 100% homology with Trypanosoma cruzi strain MT3869 (GenBank access ion number AF303660.1). The sequence obtained in this study was deposited in the GenBank (access ion number JQ912643). DISCUSSION Dogs might serve as valuable sentinels for the presence of Chagas disease because once infected, they can develop pathological alterations that are similar to those detected in humans. Moreover, they are considered the experimental model of choice for human Chagas disease4,20 . Clinical signs such as limb edema, flaccid paralysis, and acute death were associated with cardiac and central nervous failure. Myocarditis and meningoencephalitis, in humans and animals, often culminate in death due to myocarditis16,18 . 6 Serum biochemistry and blood changes are not specific in Chagas disease; however, in the acute phase, an increased activity of liver enzymes and azotemia occur8. The occurrence of leukocytosis has not been reported in T. cruzi infections, however, the decrease in total blood cell count due to bone marrow hypoplasia is observed13. Regardless of the presence of amastigotes in the bone marrow sample, in this case, the abortion might have caused neutrophilia, possibly due to parasite infection . Congenital infection has been described in infected dogs17. No increase of total serum protein was detected similar to the results described by Barr et al.5. The decrease in serum albumin and globulin levels might be related to antigen stimulation caused by another trypanosomatid agent, w hich could alter the albumin/globulin ratios1. The identification of hypoalbuminemia in this case, due to liver disorders, cannot be ignored because of the presence of bilirubinuria and hepatitis on the histopathology results. The diagnosis of Chagas disease is often missed because of the characteristics of a multisystem infection; however, the number of trypomastigote forms in the acute phase supports the diagnosis5. The treatment with diminazene diaceturat e shows better results in T. evansi infections12 ; nevertheless a significant reduction in the number of trypomastigotes in the bloodstream was observed in this case. This treatment was not sufficient to cure this animal and resulted in the death. According to Bahia et al.3 (2002), the clinical presentation might be related to the type of strain involved in the infection. T. cruzi circulates in nature as a heterogeneous population complex presenting intraspecific diversity. Th e PCR analysis the microorganism of this study showed 100% homology with the MT3 869 strain that belongs to the T. cruzi ZIII strain, described primarily as wild strain. However, reports 7 of human infection with different clinical presentations of the disease associated with this strain have been described9. Despite that there are no records of acute Chagas disease in humans in the city of Cuiabá , this is the first report of the disease in dogs in this region representing an alert to health professionals and authorities on the possibility of transmission of this zoonosis. REFERENCES 1. Almeida MAO, Jesus EEV, Sousa - Atta MLB, Alves LC, Berne MEA, Atta AM . Clinical and serological aspects of visceral leishmaniasis in Northeast Brazilian dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Vet Parasitol. 2005;127:227 - 232. 2. Araújo FMG, Bahia M T, Magalhães NM, Martins - Filho OA, Veloso VM, Carneiro CM, et al. Follow - up of experimental chronic Chagas’ disease in dogs use of polymerase chain reaction (PCR) compared with parasitological and serological methods. Acta Trop. 2002; 81:21- 31. 3. Bahia MT , Tafuri WL, Caliari MV, Veloso VM, Carneiro CM, Coelho GLLM, et al. Comparison of Trypanosoma cruzi infection in dogs inoculated with blood or metacyclic trypomastigotes of Berenice- 62 and Berenice- 78 strains via intraperitoneal and conjunctival routes. Rev Soc Bras Med Trop. 2002;35(4):339 - 345. 4. Barbabosa- Pliego A, Díaz - Albiter HM, Ochoa - García L, Aparicio - Burgos E, López - Heydeck S, Velásquez - Ordoñez V, et al. Trypanosoma cruzi circulating in the southern region of the State of Mexico (Zumpahuacán) is pathogenic: a dog model. Am J Trop Med Hyg . 2009;81:390 - 395. 8 5. Barr SC, Gossett KA, Klei TR. Clinical, clinicopathologic, and parasitologic observation of trypanosomiasis in dog infected with North American Trypanosoma cruzi isolates. Am J Vet Res. 1991; 52(6):954- 60. 6. Crisante G, Rojas A, Teixeira MMG, Añez N. Infected dogs as a risk factor in the transmission of human Trypanosoma cruzi infection in western Venezuela. Acta Trop. 2006;98:247 - 254. 7. Cruz - Chan JV, Bolio - González M, Colín - Flores R, Ramirez - Sierra MJ, Quijano - Hernandez I, Dumonteil E. Immunopathology of natural infection with Trypanosoma cruzi in dogs. Vet Parasitol . 2009; 162:151- 155. 8. Dias JCP, Neto VA, Luna EJA. Mecanismos alternativos de transmissão do Trypanosoma cruzi no Brasil e sugestões para sua prevenção. Rev Soc Bras Med Trop. 2011;44(3):375 - 379. 9. Freitas JM, Augusto - Pinto L, Pimenta JR, Bastos - Rodrigues L, Gonçalves VF, Teixeira SMR, et al. Ancestral genomes, sex, and the population struture of Trypanosoma cruzi. PLOS Pathogens 2006; 2:226- 235. 10. González - Vieyra SD, Ramírez - Durán N, Sandoval - Trujillo ÁH, Váz quez - Chagoyán JC, Monroy - Salazar HG, Barbabosa - Pliego A. Trypanosoma cruzi in dogs: electrocardiographic and echocardiographic evaluation, in Malinalco, State of Mexico. Res Rep Trop Med. 2011;2:155 - 161 11. Gurtler RE, Cecere MC, Lauricella MA, Cardinal MV, Kitron U, Cohen JE. Domestic dogs and cats as source of Trypanosoma cruzi infection in rural northwestern Argentina. Parasitology 2007;134:69 - 82 9 12. Howes F, Silva AS, A thayde CL, Costa MM, Corrêa MMB, Tavares KCS, et al. A New Therapeutic Protocol for Dogs Infected with Trypanosoma evansi. Acta Sci Vet. 2011; 39(3):988. 13. Marcondes MCG, Borelli P, Yoshida N, R Momtchilo. Acute Trypanosoma cruzi infection is associated with anemia, thrombocytopenia, leukopenia, and bone marrow hypoplasia: reversal by nifurtimox treatment . Microbes infect. 2000;2:347 - 352. 14. Pascon JPE, Sousa MG, Camacho AA. Parâmetros ecocardiográficos de cães cronicamente infectados com Trypanosoma cruzi (Cepa Colombiana). Rev Port Ciênc Vet. 2009;104(569 - 572):55- 60. 15. Paula AM. Avaliação do Programa de Controle da Doença de Chagas do Estado de Mato Grosso entre 2001 a 2010, março, 2012. 16. Pavarini SP, Oliveira EC, Bandarra PM, Leal JS, Umezawa ES, R ozza DB, et al. Miocardite chagásica em caninos no Estado do Rio Grande do Sul. Ciênc Rural, 2009;39(4): 1243- 1247. 17. Rassi A, Amato Neto V, Rassi GG, Amato VS, Rassi Júnior A, Luquetti AO, et al. Busca retrospectiva da transmissão maternal da infecção ch agásica em pacientes na fase crônica. Rev Soc Bras Med Trop. 2004; 37(6):485 - 489. 18. Silva AA, Pereira GV, Souza AS, Silva RR, Rocha MS, Lannes - Vieira J. Trypanosoma cruzi - Induced Central Nervous System Alterations: From the Entry of Inflammatory Cells to Potential Cognitive and Psychiatric Abnormalities. Journal of Neuroparasitology, 2010; 1:13p. Article ID N100901 19. Smith A, Clark P, Averis S, Lymbery AJ, Wayne AF, Morris KD , et al. Trypanosomes in a declining species of threatened Australian marsupial, the 10 brush- tailed Bettongia penicillata (Marsupialia: Potoroidae). Parasitology, 2008;135:1329 - 1335. 20. Souza AI, Paulino - Junior D, Sousa MG, Camacho AA. Aspectos clínico - laboratoriais da infecção natural por Trypanosoma cruzi em cães de Mato Grosso do Sul. Cienc Rural, 2008; 38(5):1351- 6. 21. WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/index.html 11 Fig. 1: (A) Histological analysis revealing presence de amastigotes surround by mononuclear cells in myocardium interstice (arrow), stained with hematoxylin - eosin, 100x magnifications ; and (B) severe multizonal lymphohistiocytic cellular infiltrates in the myocardial interstitium, 4 0x magnification . LW-1/10LICENÇA Certificamos que o protocolo (P-52/09-3), intitulado "Avaliação clínica e laboratorial de cães domésticos em áreas com ocorrência de casos de leishmaniose visceral, em Cuiabá, estado de Mato Grosso.", sob a responsabilidade de ARLEANA DO BOM PARTO FERREIRA DE ALMEIDA, foi aprovado de acordo com os Princípios Éticos no Uso de Animais, atendendo, inclusive, aos princípios da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Esta licença tem validade até 01/03/2014 e inclui o uso total de : Canis familiaris - 215 Machos. - 215 Fêmeas. Rio de Janeiro, 1 de março de 2010 Drº Norma Vollmer Labarthe Coordenadora Comissão de Ética no Uso de Animais Vice-presidência de Pesquisa e Laboratórios de Referência - Fundação Oswaldo Cruz Av. Brasil, 4036 - Prédio da Expansão - sala 200 - Manguinhos - Rio de Janeiro / RJ Telefone: (21) 3882.9121 e-mail: ceua@fiocruz.br Leishmaniose Canina em Cuiabá Data: _________ Nº: _______ Identificação do Animal Exame Clínico Estado Geral: Bom ( ) Regular ( ) Ruim ( ) Condição Corpórea: Muito magro ( ) Magro ( ) Normal ( ) Obeso ( ) Mucosas: Hipocoradas ( ) Normocoradas ( ) Hiperêmicas ( ) Ictéricas ( ) Desidratação: Ausente ( ) Leve ( ) Severa ( ) Prenhez: Sim ( ) Não ( ) Presença de Ectoparasitas: Não ( ) Piolhos ( ) Pulga ( ) Carrapatos ( ) Outros: ____________________________ Lesões Cutâneas: Sim ( ) Não ( ) Início das Lesões: ___________________________ Nº de Lesões: _______________________ Localização das Lesões: Orelha ( ) Nariz ( ) Escroto ( ) Outro:_________________________________ Uso de Medicamento: Sim ( ) Não ( ) Especificar: _____________________________________________ Sinais Clínicos Sintomático ( ) Assintomático ( ) Oligossintomático ( ) Apatia ( ) Anorexia ( ) Caquexia ( ) Emagrecimento ( ) Esplenomegalia ( ) Hepatomegalia ( ) Linfadenopatia Local ( ) Linfadenopatia generalizada ( ) Onicogrifose ( ) Epistaxe ( ) Atrofia muscular ( ) Artralgia ( ) Paresia dos Membros Posteriores ( ) Edema de Membros ( ) Dor a palpação Renal ( ) Distúrbios Urinários ( ) Especificar: ___________________________________________ Oftalmopatia ( ) Especificar: ___________________________________________ Dermatopatia ( ) Alopecia local ( ) Alopecia generalizada ( ) Pêlo opaco ( ) Descamação ( ) Alopecia periocular ( ) Ulcera de ponta de orelha ( ) Nódulos cutâneos ( ) Ùlceras cutâneas ( ) Hiperqueratose ( ) Outros: ________________________________________________________________________ Proprietário: _________________________________________________ Fone: _____________ Endereço: ______________________________________________________________________ Bairro: ________________________________ Cidade: _______________ Zona: _____________ Nome: ___________________ Raça: __________________ Sexo: _________Idade: _________ Pelagem: Curto ( ) Longo ( ) / Castração: Sim ( ) Não ( ) Aspectos Demográficos Local/cidade de origem: Cuiabá ( ) Outros ( ) Especificar:_____________________________ Há quanto tempo reside com a família: ≤ 1 ano ( ) > 1 ano ( ) Função na casa: Guarda ( ) Companhia ( ) Caça ( ) Permanência na casa: Dentro ( ) Quintal ( ) Nasceu na casa: Sim ( ) Não ( ) Tem acesso à rua: Sim ( ) Não ( ) Presença de carrapato: Sim ( ) Não ( ) Convive com outros animais: Sim ( ) Não ( ) Cão ( ) Gato ( ) Outros animais possuem feridas: Sim ( ) Não ( ) Pessoas da casa possuem feridas: Sim ( ) Não ( ) Vacinado: Leishmune® ( ) Outros ( ) Não ( ) Proximidade com: Mata ( ) Terreno Baldio ( ) Rio/Córrego/Represa ( ) Não ( ) < 100 metros > 100 metros Galinheiro/chiqueiro na casa: Sim ( ) Não ( ) Plantação (banana, etc) na casa: Sim ( ) Não ( ) Mosquito palha na residência: Sim ( ) Não ( ) Tem acesso à zona rural*: Sim ( ) Não ( ) Frequentemente ( ) ou Esporadicamente ( ) Proprietário conhece a doença: Sim ( ) Não ( ) Animal doente na vizinhança: Sim ( ) Não ( ) Pessoa doente na vizinhança: Sim ( ) Não ( ) Visita do CCZ: Sim ( ) Não ( ) Coleta pública de Lixo: Sim ( ) Não ( ) Detetização da residência: Sim ( ) Não ( ) * Residência localizada em ambiente urbano Material Coletado Biópsia para Cultura: Pele de Orelha ( ) Pele de Escápula ( ) Lesão ( ) Não Coletado ( ) PCR: Pele integra ( ) Lesão ( ) Linfonodo ( ) Medula óssea ( ) Sangue ( ) Citologia: Linfonodo ( ) Medula óssea ( ) Cultura: Medula Óssea ( ) Linfonodo ( ) Sangue ( ) Imunohistoquímica: Pele ( ) Sorologia Sim ( ) Não ( ) Observações ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ FUNDA NAÇAÃOSWLCUNA RÃAZOWAIA TRÃA EUZÃUOÇRNA IR PUQÍNUAV EUOHGIUNAVM BPBPÊ M FBÁP,:É Ó ,J                                  !  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