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Title: Proteoma e Fosfoproteoma quantitativo durante o estresse nutricional da forma epimastigota de Trypanosoma cruzi
Advisor: Marchini, Fabricio K.
Members of the board: Souza, Tatiana de A. C.B. de
Ornelas, Carlos André
Holetz, Fabíola Barbieri
Authors: Lucena, Aline Castro Rodrigues
Coadvisor: Godoy, Lyris M. F. de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Durante a metaciclogênese in vitro, a forma epimastigota de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, se diferencia em tripomastigota metacíclica após ser submetido a estresse nutricional em meio TAU, com isso, adquire a capacidade de infectar o hospedeiro vertebrado. Durante a diferenciação, os parasitas sofrem diversas adaptações que incluem a modulação de modificações pós-traducionais. Em um trabalho recente, nosso grupo delineou, sem quantificar, o perfil de fosforilação em T. cruzi durante a metaciclogênese. Neste trabalho, visando realizar a quantificação dos sítios de fosforilação, foi utilizada a metodologia SILAC, que marca proteínas durante o cultivo celular, através da incorporação de aminoácidos contendo isótopos pesados. Visando compreender a sinalização através de fosforilação que ocorre nos momentos iniciais de metaciclogênese, ou seja, durante o estresse nutricional, foram selecionados os pontos epimastigotas em crescimento exponencial (epimastigotas 3 dias, EPI-3D) e na fase estacionária (epimastigotas 5 dias – EPI-5D), bem como alguns pontos ao longo do estresse nutricional (5 e 15 minutos, 1 e 2 horas). Para cada ponto experimental, os peptídeos foram digeridos, fracionados por FR básica, então os fosfopeptídeos foram enriquecidos utilizando beads de TiO2, e analisados por LC-MS/MS. Foram identificados 5.405 grupos de proteínas, 1.679 grupos de fosfoproteínas, 3.893 grupos de sítios de fosforilação sendo 3049 em Serina, 786 em Treonina vii e, 58 em Tirosina, entre os quais cerca de 99% foram quantificados. As análises foram realizadas de duas formas: inicialmente comparando as diferentes fases de cultivo celular (exponencial e estacionária), e os diferentes pontos ao longo do estresse nutricional. Foram observadas diversas alterações no perfil de expressão das proteínas e modulação dos sítios de fosforilação, envolvidos em diversos processos como síntese de ácidos graxos, sinalização celular, locomoção, estresse oxidativo, processamento de RNA, entre outros. Projetos “ômicos”, assim como este, são importante para gerar listas com um número limitado de alvos para posterior caracterização. Nesse sentido, nós objetivamos caracterizar alguns dos elementos apontados visando elucidar o “gatilho” da metaciclogênese.
Abstract: During metacyclogenesis in vitro, the epimastigote form of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, differentiates into metacyclic trypomastigote, after nutritional stress in TAU medium, and acquires capability to infect the vertebrate host. During differentiation, the parasites suffer several adaptations that include modulation of post-translational modulations. In a recent work, our group outlined, without quantifying, the protein phosphorylation profile of T. cruzi during metacyclogenesis. Here, in order to accomplish the quantification the phosphorylation sites, we applied the SILAC methodology, which labels proteins by incorporation of amino acids containing heavy isotopes, in culture. Aiming to understand the signaling that occurs through phosphorylation in the initial moments of metacyclogenesis, that is, during the nutritional stress, epimastigotes in exponential growth (Epimastigote 3 days, EPI-3D) and in the late log phase (Epimastigote 5 days, EPI-5D), as well as several points during the nutritional stress (5 and 15 minutes, 1 and 2 hours) were selected. For each experimental point, peptides were digested, fractionated by basic RP, then phosphopeptides were enriched with TiO2 beads, and analyzed by LC-MS/MS. In total, 5,405 proteins groups were identified, including 1,679 groups of phosphoproteins and 3,893 phosphorylation sites, being 3,049 in Serine, 786 in Threonine and, 58 in Tyrosine residues, among which around 99% were quantified. The analyzes were performed in two ways: first comparing the ix different stages of cell growth (exponential and stationary), and the different points along the nutritional stress. Several changes were observed in the expression profile of the proteins and modulation of the phosphorylation sites, involved in various processes such as fatty acid synthesis, cell signaling, mobility, oxidative stress, RNA processing, among others. Omics projects like this one are important to generate lists that have limited number of targets for further characterization. In this sense we aim to characterize some of the elements pinpointed to elucidate the trigger of metacyclogenesis.
keywords: Estresse Nutricional
Proteoma
Fosfoproteoma
SILAC
Metaciclogenese
Issue Date: 2015
Citation: LUCENA, Aline Castro Rodrigues. Proteoma e Fosfoproteoma quantitativo durante o estresse nutricional da forma epimastigota de Trypanosoma cruzi. 2015. xvii, 101 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, Curitiba, PR, 2015.
Date of defense: 2015-02-25
Place of defense: Curitiba - Auditório ICC
Department: Biociencias e Biotecnologia
Defense institution: Intituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia.
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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