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Title: Obtenção e caracterização molecular de mosquitos Aedes fluviatilis transgênicos para o bloqueio da malária aviária
Advisor: Moreira, Luciano Andrade
Members of the board: Moreira, Luciano Andrade
Peixoto, Alexandre A.
Marrel, Mauro Toledo
Pereira, Marcos Horácio
Pimenta, Paulo Filemon Paolucci
Authors: Rodrigues, Flávia Guimarães
Coadvisor: Brito, Cristiana Ferreira Alves de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: A manipulação genética de mosquitos possibilita a inserção de moléculas efetoras que podem inibir o desenvolvimento de espécies de Plasmodium . O presente trabalho teve como objetivo estudar duas moléculas antiparasíticas [gomesina e fosfolipase A 2 (PLA 2 m)] como candidatas à expressão em mosquitos. O peptídeo antimicrobiano gomesina da aranha Acanthoscurria gomesiana , foi capaz de inibir o desenvolvimento das formas sanguíneas das cepas W2 e 3D7-GFP de P. falciparum , com valores de IC 50 de 75,8 e 86,6 μ M, respectivamente. Além disso, mostramos que esta molécula na concentração foi capaz de reduzir em até 100% o desenvolvimento de oocinetos de P. berghei (a 50 μ M) e oocistos de P. falciparum (a 100 μ M) Anteriormente, experimentos in vitro, mostraram que a enzima fosfolipase A 2 (PLA 2 ) isolada do veneno de abelha apresentou ação inibitória sobre o desenvolvimento de P. falciparum e P. gallinaceum , mas apresentou efeitos deletérios em mosquitos transgênicos, quando na sua forma ativa. Neste trabalho, expressamos em bactérias e purificamos uma forma mutante da proteína (PLA 2 m). Na concentração de 0,1 μ mol/l a proteína recombinante foi capaz de reduzir em até 79% o número de oocistos de P. gallinaceum em mosquitos Aedes fluviatilis , quando adicionada ao sangue de aves domésticas ( Gallus gallus domesticus ) infectadas. Para a geração de mosquitos transgênicos utilizamos o promotor da proteína 1 da matriz peritrófica de An. gambiae (AgPer1) para dirigir a expressão do gene da PLA 2 m. A construção do gene híbrido (AgPer1/PLA 2 m) foi inserida no elemento de transposição piggyBac , que contém como marcador, o gene da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP). Pela microinjeção de 770 embriões, foram formadas 15 famílias e, após a seleção de cerca de 22.000 larvas foram obtidas quatro linhagens transgênicas, representando uma eficiência na transformação de 27%. A expressão do EGFP foi observada no tubo neural e olhos de larva, pupa e adulto. Utilizando iniciadores específicos, confirmamos, pela PCR, a presença dos genes EGFP (700pb) e PLA 2 m (500bp). A produção do RNAm da PLA 2 m foi específica no intestino de fêmeas, não variando após a alimentação sanguínea. Por microscopia confocal detectamos a presença da proteína PLA 2 m no intestino dos mosquitos transgênicos. Além disso, ensaios de bloqueio ao parasita mostraram redução significativa do desenvolvimento de oocistos de P. gallinaceum , de 17,5 a 68,5%, nas quatro linhagens transgênicas. Este estudo mostra a importância de moléculas efetoras e da geração de mosquitos transgênicos como estratégia alternativa de controle da malária, bem como, uma ferramenta para estudos de interação parasita/ vetor inverteb
Abstract: The genetic manipulation of mosquitoes allows the insertion of effector molecules to block the development of Plasmodium spp. This work aimed to study two antiparasitic molecules [gomesin and phospholipase A 2 (mPLA 2 )] as candidates for expression in transgenic mosquitoes. Gomesin, an antimicrobial peptide from the Acanthoscurria gomesiana spider, was able to inhibit the growth of intraerythrocitic stages of both W2 and 3D7-GFP P. falciparum strains, at IC 50 of 75.8 and 86.6 μ M, respectively. Furthermore, we showed that this molecule was able to reduce up to 100% the development of P. berghei ookinetes (at 50μM) and P. falciparum oocysts (at 100μM). Previously, in vitro experiments have sh own that the bee venom phospholipase A 2 (PLA 2 ) inhibits both P. falciparum and P. gallinaceum oocyst development, although it also presented deleterious effects to mo squitoes when expressed in transgenic anophelines, as an active enzyme. In this work , we expressed in bacteria and purified a mutant form of PLA 2 (mPLA 2 ). When mixed with P. gallinaceum infected blood, at 0,1 μ mol/l, the mPLA 2 recombinant protein was able to reduce up to 79% the number of oocysts in Aedes fluviatilis mosquitoes. In order to generate transgenic mosquitoes we used the Anopheles gambiae peritrophic matrix protein 1 pr omoter (AgPer1) to drive the mPLA 2 expression. The hybrid gene construct (AgPer1/mPLA 2 ) was inserted into the piggyBac transposable element which contains the green fluorescent protein gene (EGFP), as a marker. By injecting 770 Ae. fluviatilis embryos 15 families were formed and, after screening more than 22,000 larvae, we obtained four transgenic lines (27% of transformation efficiency). EGFP expression was observed on eyes and neural tubes of mosquito larvae, pupae and adult. Employing specific primers we confirmed, by PCR, the presence of the EGFP (700bp), as well as the mPLA 2 (500bp) genes. The effector molecule (mPLA 2 ) mRNA expression was specific to female midguts and was not induced by a blood. By confocal microscopy we detected the presence of the mPLA 2 protein only in transgenic mosquitoes ́ mi dguts. Moreover, paras ite blocking assays showed signific ant reduction on P. gallinaceum oocyst numbers (17.5 to 68.5%) in all four transgenic lines. This study shows the importance of parasite effector molecules and the generation of transgenic mosquitoes as an alternative malaria control strategy as well as a tool in studies of vector/parasite interaction
keywords: Mosquito transgênico 2.
ária aviária 3. PL
Issue Date: 2007
Citation: RODRIGUES, Flávia Guimarães. Obtenção e caracterização molecular de mosquitos Aedes fluviatilis transgênicos para o bloqueio da malária aviária. 2007. Tese( Doutorado em Ciências da Saúde - Biologia Celular e Molecular)-Ministério da Saúde. Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas René Rachou. Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde. Belo Horizonte. 2007
Date of defense: 2007
Place of defense: Belo Horizonte/MG
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Teses de Doutorado

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