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Title: Uso das sirtuínas do Trypanosoma cruzi como alvos moleculares no desenvolvimento de fármacos para o tratamento da doença de chagas.
Advisor: Soares, Milena Botelho Pereira
Members of the board: Moretti, Nilmar Silvio
Veras, Patricia Sampaio Tavares
Reis, Mitermayer Galvão dos
Oliveira, Geraldo Gileno de Sá
Soares, Milena Botelho Pereira
Authors: Bastos, Tanira Matutino
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Abstract: INTRODUÇÃO: A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, afeta em torno de 6 a 7 milhões de pessoas mundialmente. O benznidazol e o nifurtimox, medicamentos utilizados no tratamento da doença, apresentam eficácia limitada, e estão associados com a presença de efeitos colaterais graves. Portanto, torna-se necessária a identificação de novos alvos farmacológicos para a seleção de moléculas com boa eficácia contra o parasito e baixa toxicidade. Neste contexto, devido ao fato de atuarem em processos celulares vitais, as sirtuínas têm atraído interesse como potenciais alvos farmacológicos para o tratamento de diferentes doenças, incluindo a doença de Chagas. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi caracterizar as sirtuínas de T. cruzi, TcSir2rp1 e TcSir2rp3, como alvos farmacológicos para a identificação de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas. METODOLOGIA: As TcSir2rp1 e TcSir2rp3 recombinantes foram produzidas utilizando sistema de expressão em bactérias e purificadas para posterior validação da atividade biológica das enzimas e triagem de 48 moléculas sintéticas e isoladas de produtos naturais. As moléculas que apresentaram atividade inibitória para as enzimas foram investigadas para avaliar o potencial em inibir as formas tripomastigota e amastigota do parasito, além da toxicidade em fibroblastos humanos. Além disso, foi investigada a propriedade antiparasitária in vivo de outros compostos que, apesar de não inibirem as sirtuínas do parasito, apresentaram atividade antiparasitária nos ensaios de triagem em sistema de High Content Screening padronizado para atividade tripanocida. RESULTADOS: As sirtuínas recombinantes produzidas apresentam atividade de lisina desacetilase NAD+ dependente, sendo demonstrado, pela primeira vez, a atividade biológica de TcSir2rp1 em ensaio funcional. Dentre os 48 compostos que foram triados, 10 apresentaram atividade inibitória de sirtuínas do parasito, sendo 3 inibidores de TcSir2rp1 (compostos 14, 17 e 40), 5 deles inibidores de TcSir2rp3 (compostos 10, 12, 13, 33 e 35) e 2 inibidores de ambas as sirtuínas do parasito (compostos 43 e 44). Foi verificada atividade antiparasitária de todos os compostos selecionados no ensaio de triagem com as enzimas recombinantes. Porém, o ensaio de toxicidade em fibroblasto humano indica que a atividade destes compostos não é seletiva. Dentre os compostos que não inibiram as sirtuínas de T. cruzi, mas apresentaram atividade antiparasitária potente e seletiva (compostos 45, 46, 47 e 48), 2 deles foram selecionados para o ensaio de atividade em camundongo (compostos 45 e 48) e apesar do tratamento in vivo causar a redução da parasitemia, os animais vieram ao óbito, com sinais de toxicidade. CONCLUSÕES: Este trabalho reforça o uso das sirtuínas do parasito como alvos farmacológicos, com a identificação de diferentes compostos que podem ser otimizados através da química medicinal com o intuito de identificar moléculas mais seletivas e potentes para serem usadas no tratamento da doença de Chagas.
Abstract: INTRODUCTION: Chagas disease, caused by protozoa parasite Trypanosoma cruzi, affects around 6 to 7 million people worldwide. Nifurtimox and benznidazol, the drugs used in the treatment of the disease, have limited efficacy and have been associated with severe side effects. Thus, there is an urgent need to find new biotargets for the identification of compounds with good efficacy against the parasite and low toxicity. In this context, due to their biological function on vital cellular processes, sirtuins have attracted interest as potential pharmacological targets for the treatment of different diseases, including Chagas disease. OBJECTIVE: The objective of this study was to characterize T. cruzi sirtuins, TcSir2rp1 and TcSir2rp3, as pharmacological targets for the identification of new drugs for the treatment of Chagas disease. METHODOLOGY: For this, recombinant TcSir2rp1 and TcSir2rp3 were produced, using expression system in bactéria, and purified for subsequent validation of biological activity of enzymes and screening of 48 synthetic molecules or isolated from natural products. The molecules that presented inhibitory activity for enzymes were investigated to assess the potential to inhibit the trypomastigote and amastigote forms of the parasite, and the toxicity effect in human fibroblasts. In addition, we also investigated the antiparasitic effects in vivo of other compounds which, although did not inhibit the sirtuin activity, showed anti-T. cruzi activity when screened in vitro using the High Content Screening System. RESULTS: The recombinant sirtuins produced presented NAD + dependent lysine desacetilase activity, being the first time this is shown for TcSir2rp1 in a functional test. Among the 48 compounds screened, 10 showed inhibitory activity of T. cruzi sirtuins, being 3 TcSir2rp1 inhibitors (compounds 14, 17 and 40), 5 of them anti-TcSir2rp3 (compounds 10, 12, 13, 33 and 35) and 2 inhibitors of both sirtuins of the parasite (compounds 43 and 44). Antiparasitic activity was found in all compounds selected in screening assays with recombinant enzymes. However, the toxicity test in human fibroblasts indicates that the activity of these compounds is not selective. Among the compounds that did not inhibit the sirtuins of T. cruzi, but showed potent and selective antiparasitic activity (compounds 45, 46, 47 and 48). Two of them (compounds 45 and 48) were tested in vivo in T. cruzi-infected mice, and although they caused a reduction of parasitemia, mortality was seen associated with signs of drug toxicity. CONCLUSIONS: This study reinforces the use of the sirtuins of the parasite as pharmacological targets, with the identification of different compounds that can be optimized through the medicinal chemistry in order to identify more selective and potent molecules to be used in the treatment of Chagas disease
Keywords: Chagas disease
Trypanosoma cruzi
Sirtuins
Pharmacological target
Drug development
keywords: Doença de Chagas
Trypanosoma cruzi
Sirtuínas
Alvos farmacológicos
Desenvolvimento de fármacos
Issue Date: 2017
Publisher: Instituto Gonçalo Moniz
Citation: BASTOS, T. M. Uso das sirtuínas do Trypanosoma cruzi como alvos moleculares no desenvolvimento de fármacos para o tratamento da doença de chagas. 2017. 128 f. il. Tese (Doutorado em Patologia) – Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Gonçalo Moniz, Salvador, 2017.
Date of defense: 2017-09-21
Place of defense: Salvador/Ba
Department: Coordenação de Ensino
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz
Program: Pós-Graduação em Patologia
Copyright: open access
Appears in Collections:BA - IGM - Teses de Doutorado



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