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Title: O papel da histona desacetilase 4 (TgHDAC4) na regulação da Expressão Gênica de Toxoplasma gondii
Advisor: Nardelli, Sheila Cristina
Ávila, Andréa Rodrigues
Members of the board: Alves, Lysangela Ronalte
Picchi, Gisele
Medeiros, Lia Carolina A. S. de
Authors: Fragoso, Mariana Sayuri Ishikawa
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório membro do filo Apicomplexa e responsável pela toxoplasmose, doença que afeta um quarto da população mundial e para a qual não há cura até o momento. Para sobreviver às barreiras do sistema imune, T. gondii se diferencia em diferentes estágios, sendo este processo, regulado pelo controle da expressão gênica. A regulação epigenética parece ter um papel fundamental neste parasita e dentre as enzimas que atuam nessa via, estão as histonas desacetilases (HDACs). O T. gondii possui sete histonas desacetilases (HDACs e Sir2), que são agrupadas em quatro classes de acordo com seus domínios, seus cofatores e sua sequência. O objetivo da presente dissertação foi realizar a caracterização da TgHDAC4, uma desacetilase classe IV, cujo único membro caracterizado é a histona desacetilase 11 (HDAC11) encontrada apenas em metazoários. TgHDAC4 possui dois sinais preditos: um de exportação nuclear e um de clivagem, cujas funções não estão caracterizadas. A busca por sequências similares, mostram que TgHDAC4 é uma proteína conservada exclusivamente em parasitas apicomplexas, cuja única região comum com outras espécies é a região do domínio HDAC característico. Para o estudo dessa enzima, focamos na construção de ferramentas de genética reversa, como o etiquetamento da proteína endógena e o nocaute de TgHDAC4. As construções destas ferramentas foram dificultadas devido a um erro de anotação na região C-terminal do gene no banco de dados de Toxoplasma, onde encontra-se um domínio HDAC incompleto, resultando em massa molecular predita de 98 kDa. A partir do sequenciamento da porção final do gene, foi possível encontrar o códon de terminação em fase, resultando em dois éxons a mais do que o predito, o que resultaria em uma proteína de 124 kDa. Uma vez corrigido, realizamos o etiquetamento na porção C-terminal da proteína endógena, adicionando uma etiqueta de HA e a partir de ensaios de imunofluorescência indireta e co-localização, foi possível verificar que TgHDAC4 está localizada no apicoplasto, co-localizando com a proteína FDR (Ferrodoxina-NADP+ reductase). Ensaios de western blot identificaram uma proteína de cerca de 100 kDa, um pouco menor do que o esperado. Também foram feitas diversas tentativas de nocaute por PCR de fusão, porém, apesar de ocorrer uma seleção dos transfectantes a partir do uso de drogas, nunca foram obtidos parasitas nocaute para TgHDAC4. Foi utilizado também, o sistema CRISPR-Cas9, gentilmente cedido pelo Dr. Hakimi (University Grenoble Alpes-França). Os plasmídeos foram transfectados e ensaios de imunofluorescência mostraram o parasita com uma morfologia alterada, especialmente no núcleo, porém, não foi possível a obtenção de parasita com mutações no gene que codifica TgHDAC4. Nossos dados indicam pela primeira vez a presença de uma desacetilase de histona no apicoplasto de Toxoplasma, cuja sequência é única a parasitas Apicomplexa. O apicoplasto é uma organela de origem endossimbiótica secundária, sendo considerado o calcanhar de Aquiles do parasita, por se tratar de organela essencial para sua sobrevivência. Entender como essa proteína atua, poderá fornecer novos dados não somente quanto a biologia dessa organela, mas futuramente identificar potenciais alvos para o tratamento efetivo da toxoplasmose.
Abstract: Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite member of the phylum Apicomplexa and is responsible for toxoplasmosis, a disease that affects a quarter of the world’s population and which has no effective cure. In order to pass immune barriers, T. gondii differentiates between different stages, which is tightly regulated by controlling gene expression. Epigenetic regulation is one of the mechanisms controlling gene expression that seems to play an important role in T. gondii. One category of enzymes that act as epigenetic regulators are histone deacetylases (HDACs). T. gondii has seven histone deacetylases (HDACs and Sir2), which are classified into four classes according to their domains, cofactors and sequence. The aim of the present dissertation was to characterize TgHDAC4, a histone deacetylase of class IV, a class of which the only well characterized member is HDAC11, found only in metazoans. TgHDAC4 has two predicted signals: a possible nuclear export signal and a cleavage, whose functions have yet to be confirmed. Searches for similar sequences showed that TgHADC4 is conserved in some members of the phylum Apicomplexa, and the only region common to other species is the typical HDAC domain. In order to characterize TgHDAC4, we focused on construction of epitope tagged lines and knockouts. The construction of these tools was delayed due to misannotation of the C-terminal portion of tghdac4 gene present on ToxoDB (the T. gondii database). According to ToxoDB, TgHDAC4 is a large protein with an incomplete HDAC domain at the C-terminal domain, resulting in a predicted molecular mass of 98 kDa. After resequencing the final portion of tghdac4, we identified the correct stop codon, which resulted in two more exons than predicted, and an approximate protein size of 124 kDa. With the correct sequence, we constructed endogenous tagged lines, adding a HA tag to the C-terminal portion of TgHADC-4. By indirect immunofluorescence and co-localization assays, we verified that TgHDAC4 is located in the apicoplast, also co-localizing with FDR protein (Ferredoxin-NADP+ reductase). Western blot assays identified a protein smaller than expected, of about 100 kDa. Several attempts to construct knockout lines failed, despite successful drug selection. This is likely due to a misannotation problem. As an alternative, we used the CRISPR/Cas9 system (constructs provided by Dr. Hakimi-University of Grenoble Alpes, France). Plasmids were transfected and used for immunofluorescence assays. Parasites that stained positively for GFP showed atypical morphology, especially in nuclei. On the other hand, so far it was not possible to identify parasite clones with specific mutations on tghdac4. Our data indicate for the first time the presence of a histone deacetylase in the T. gondii apicoplast, which seems to be unique to Apicomplexa parasites. The apicoplast is an organelle acquired from endosymbiotic origin, considered the “Achilles’ Heel" of the parasite, due to its importance for parasite survival. Understanding how this protein works could provide new insights into the metabolism of the apicoplast and in addition reveal a potential drug target for the effective treatment of toxoplasmosis.
Keywords: Parasitology
Toxoplasmosis
Histone Deacetylases
Apicoplasts
keywords: Apicomplexa
DeCS: Parasitologia
Toxoplasma
Toxoplasmose
Histona Desacetilases
Apicoplastos
Issue Date: 2017
Citation: FRAGOSO, Mariana Sayuri Ishikawa. O papel da histona desacetilase 4 (TgHDAC4) na regulação da Expressão Gênica de Toxoplasma gondii. 2017. 98 f. Dissertação (Mestrado em Biociencias e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, 2017, Curitiba, 2017.
Date of defense: 2017-02-10
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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