Caracterização funcional do complexo adaptador 1 (AP-1) em Trypanosoma cruzi

Abstract

O AP-1 é um complexo adaptador heterotetramérico formado pelas subunidades γ, β, μ e σ. Esse complexo auxilia a montagem do revestimento de vesículas com clatrina na rede trans-Golgi, as quais transportam enzimas deste para os lisossomos em células eucarióticas. No entanto, o papel do AP-1 no protozoário Trypanosoma cruzi – o agente causador da doença de Chagas – é totalmente desconhecido. Nesse trabalho, estudamos a função do complexo AP-1 em diferentes formas do ciclo de vida de T. cruzi. Para tanto, foi produzido uma linhagem mutante nulo para subunidade gama (TcAP1-γ) através da técnica de nocaute gênico por recombinação homóloga a fim de aferir uma função para esse adaptador nesse parasita. Outra abordagem foi identificar proteínas associadas à duas subunidades de TcAP-1 (β e μ ) por imunoprecipitação e análise por espectometria de massas. Nossos dados com o parasita nocaute para AP1-γ (TcAP1-γKO) mostraram que formas epimastigotas tiveram sua proliferação e diferenciação para a forma infectiva tripomastigota metacíclicos reduzidas (comparando com parasita selvagem) após a deleção da proteína. Os parasitas TcAP1-γKO também mostraram uma significativa redução na capacidade de infectar células de mamíferos (HeLa e VERO). Outro aspecto relevante é que o nocaute de AP1-γ prejudicou o processamento e o transporte da cruzipaína (principal cisteíno-proteínase de T. cruzi) do complexo de Golgi para os reservossomos (organelas relacionadas aos lisossomos) em T. cruzi. Para confirmar que a ausência da cruzipaína nos reservossomos nos parasitas nocaute era devido à ausência da expressão de TcAP1-γ, parasitas TcAP1-γKO foram transfectados com plasmídeo para expressão epissomal de TcAP1-γ. A complementação da expressão de TcAP1-γ no parasita TcAP1-γKO restaurou a maturação e a localização da cruzipaína nos reservossomos, sugerindo que o complexo TcAP-1 atue na rede trans-Golgi, na formação de vesículas contendo cruzipaína direcionadas aos reservossomos em T. cruzi. Além disso, análise de proteômica das proteínas associadas com TcAP1-β e TcAP1-μ fusionadas à etiqueta GFP, detectaram as subunidades TcAP1-γ e TcAP1-σ do complexo AP-1, mas não detectaram outras possíveis interações. Esse resultado indica que a etiqueta GFP provavelmente interferiu com as associações de AP-1 com outras proteínas auxiliares.