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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25611
Type
DissertationCopyright
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2019-01-21
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NOVA ESPÉCIE DE TRYPANOSOMA ISOLADA DE DIDELPHIS AURITA NA MATA ATLÂNTICA DO RIO DE JANEIRO: CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR
Lopes, Camila Madeira Tavares | Date Issued:
2016
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Parasitos do gênero Trypanosoma são capazes de infectar todas as classes de vertebrados em todos os continentes. Durante um estudo onde buscávamos detectar infecção por Leishmania spp, isolamos flagelados em baço e fígado de um Didelphis aurita proveniente do campus Fiocruz da Mata Atlântica. Observamos formas epimastigotas não compatíveis com outros tripanosomatídeos já descritos e os submetemos a caracterização biológica, morfológica e molecular. Para a análise biológica realizamos curva de crescimento e teste de viabilidade em meios de isolamento e manutenção de Trypanosoma descritos na literatura. Para a análise morfológica e morfométrica utilizamos esfregaços de cultura em fase exponencial corada pelo Giemsa; microscopia eletrônica de varredura e de transmissão A análise molecular foi realizada através de PCR (reação em cadeia da polimerase) direcionada ao gene do mini-éxon, à região parcial da subunidade menor ribossomal do gene 18S através dos marcadores 18S SSU e V7-V8, além do gGAPDH. Os produtos amplificados foram sequenciados e a edição e a construção de sequências consenso foi realizada com o programa SeqMan-DNAStar e submetidas a análise por similaridade através do algoritmo Blastn O alinhamento das sequências foi realizado no programa Mega 5 e as árvores foram construídas utilizando as análises Neighbour-Joining (NJ) e Máxima Verossimilhança (Maximum Likellihood \2013 ML). O resultado da análise biológica indicou que os parasitos se replicam quando mantidos em meio Schnneider acrescido de 10% SFB e 2% de urina humana masculina. A curva de crescimento durou 5 dias e apenas formas epimastigotas foram identificadas por microscopia de luz (coloração pelo método de Giemsa) e microscopia eletrônica de varredura. A análise morfométrica realizada em imagens de varredura não revelou diferenças significativas (P<0,05) entre as duas populações: comprimento total dos parasitos de 23,3±5,9\03BCm e 28,7±6,2\03BCm; comprimento da porção livre do flagelo de 9,5±3,2 \03BCm e 11,6±3,0\03BCm; e comprimento médio do corpo de 13,8±3,6\03BCm e 17,1±3,7\03BCm nas populações de baço e fígado, respectivamente. Como resultado da caracterização molecular, pôde-se definir que as populações de baço e fígado compunham uma mesma espécie e esta espécie apresentava maior similaridade com isolados de morcego neotropicais das Américas do Sul e Central (Trypanosoma wauwau) e espécies de Trypanosoma de marsupiais australianos. A similaridade tanto com os marsupiais australianos quanto com os morcegos neotropicais, aliada à sua posição basal no clado cruzi reacende a discussão da origem do T. cruzi e sugere que talvez as duas hipóteses atualmente apresentadas (\201CSouthern Supercontinent\201D e \201CBat seeding\201D) não sejam excludentes e sim complementares A similaridade filogenética desta nova espécie aqui descrita com espécies de Trypanosoma descritos em marsupiais australianos indica que se trata de um parasito bastante antigo que provavelmente derivou-se de um parasito ancestral presente nos marsupiais do Supercontinente Sul. Este parasito pode posteriormente ter sido adquirido por morcegos (host-switching) e originado o que hoje conhecemos como T. wauwau. Migrações de morcegos infectados e novo host-switching para hospedeiros terrestres (tal como proposto na \201CBat seeding hypothesis\201D) teria originado o T. cruzi. A nova espécie de Trypanosoma aqui descrita, juntamente com o T. wauwau seriam um elo perdido, o \201Cmissing-link\201D, entre as duas teorias que buscam explicar a história evolutiva do gênero Trypanosoma
Abstract
Parasites from Trypanosoma genus are able to infect all vertebrate classes in all continents. During a field expedition searching for Leishmania infection, we isolated flagellates in spleen and liver from Didelphis aurita in the Campus Fiocruz da Mata Atlântica, Rio de Janeiro/RJ. We observed epimastigote forms that were not compatible with other trypanosomatids already described, and decided to analyze them by biological, morphological and molecular assays. The parasites replicate when maintained in Schnneider\2019s medium with 10% FCS (Fetal Calf Serum). For biological analysis we performed viability and growth curve test in different media for Trypanosoma described in the literature. For morphological and morphometric analysis we used, exponential phase culture smears stained by Giemsa; scanning and transmission electron microscopy. Molecular analysis was performed by PCR (polymerase chain reaction) directed to the mini-exon gene, the partial region of the subunit smaller ribosomal gene 18S through 18S SSU and V7-V8 markers, beyond gGAPDH. The amplified products were sequenced and edited, and construction of consensus sequences were done with the SeqMan program DNAStar, and subjected to analysis by similarity using the Blastn algorithm. The alignment and trees were performed by Mega 5 software using the Neighbour-Joining (NJ) and Maximum Likelihood (Maximum Likellihood - ML) analysis. The biological results of growth curve presented its beginning and end of the logarithmic phase in the 2nd and 4th days, respectively, and only epimastigote forms were identified by light microscopy (Giemsa staining method) and scanning electron microscopy The morphometric analysis revealed no significant differences (p <0.05) between the two populations: total length of the parasites of 23.3 ± 28.7 ± 5,9\03BCm and 6,2\03BCm; length of the free portion of the flagella of 9.5 ± 3.2 m and 11.6 ± 3,0\03BCm; and average body length of 13.8 ± 17.1 ± 3,6\03BCm and 3,7\03BCm in populations of spleen and liver, respectively. As a result of molecular analyzes we could define that the populations of spleen and liver composed an unique species and this species presented a higher similarity with recently described isolates from Neotropical bat from South and Central America (Trypanosoma wauwau) and some Trypanosoma species from Australian marsupials. The similarity with isolates derived from both Australian marsupials and neotropical bats, combined with its position in the basal cruzi clade renews the discussion of the origin of T. cruzi and suggests that perhaps the two currently presented hypothesis ("Southern Supercontinent" and "Bat seeding") are not mutually exclusive, but complementary. The phylogenetic similarity of the new species herein described with Trypanosoma species from Australian marsupials indicates that it is a very ancient parasite that probably derived from an ancient parasite present in marsupials from the Southern Supercontinent. This parasite may subsequently have been acquired by bats (host-switching) and originated what we know as T. wauwau. Migrations of infected bats and new host-switching for terrestrial hosts (as proposed in "Bat seeding hypothesis") have originated the T. cruzi. The new species of Trypanosoma herein described, along with T. wauwau would be the missing link between the two theories proposed to explain the evolutionary history of Trypanosoma genus
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