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Title: Investigação do papel da microglia na disfunção sináptica na sepse
Advisor: Bozza, Fernando Augusto
Members of the board: Carvalho, Vinícius de Frias
Lima, Flavia Regina Souza
Figueiredo, Rodrigo Tinoco
Pereira, Cecília Hedin
Lara, Flavio Alves
Authors: Moraes, Carolina Araújo
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Os sobreviventes de sepse frequentemente apresentam um declínio dramático das capacidades físicas, psicológicas e cognitivas com importantes implicações sociais e de saúde pública. Recentes evidências demonstram que as células da microglia participam estrutural e funcionalmente do microambiente sináptico. No entanto, pouco se sabe sobre como as células da microglia são ativadas e como esta ativação pode contribuir para disfunção sináptica e perda cognitiva na inflamação sistêmica. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo entender o papel da microglia na disfunção sináptica na sepse. Usando um modelo de peritonite polimicrobiana (ligadura e perfuração cecal- CLP), nós demonstramos que após 24h de cirurgia, os animais apresentavam redução no número de sinapses excitatórias e inibitórias cerebrais identificadas pela co-localização das proteínas sinaptofisina/PSD-95 e VGAT/GABAAR, respectivamente. A perda sináptica foi acompanhada por sinais de neuroinflamação, como ativação das células da microglia e aumento na concentração de IL-1\03B2 no hipocampo. Para compreender os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nesta perda sináptica, nós utilizamos uma abordagem in vitro onde culturas de neurônios foram incubadas com o meio condicionado das células da microglia controle (MCM) ou ativadas pelo lipopolissacarídeo (MCM-LPS). Nossos resultados revelaram que o MCM-LPS induziu uma redução no número de sinapses neuronais. Além disso, a adição prévia do antagonista do receptor de IL-1\03B2 (IL-1Ra) preveniu a perda sináptica induzida pelo MCM-LPS Desta forma, fomos investigar se a ativação do inflamassomo NLRP3 estaria envolvida na produção e secreção de IL-1\03B2 pela microglia. Nossos resultados mostraram que após 24 horas da CLP houve um aumento da expressão de componentes que formam o complexo do inflamassomo NLRP3, como o receptor do tipo NLRP3, a ASC, a enzima caspase-1 e a IL-1\03B2. Adicionalmente, através da dupla marcação para Iba-1/NLRP3, observamos um aumento do receptor do tipo NLRP3 nos animais CLP que foram predominantemente expressos na microglia. Nos estudos in vitro nós constatamos que o LPS induziu aumento dos níveis de NLRP3, da caspase-1 ativa, do complexo caspase-1/ASC e IL-1\03B2 na microglia. Obervamos também que a inibição de alguns dos fatores que compõe o complexo do inflamassomo NLRP3, como o receptor do tipo NLRP3 e caspse-1, além do ROS mitocondrial interferiram na produção de IL-1\03B2 pela microglia ativada pelo LPS. Fomos ainda investigar os fenômenos secretórios associados à ativação do inflamassomo NLRP3. Observamos que as células da microglia liberaram mais microvesículas (MV) quando ativadas pelo LPS. Quando analisamos a composição proteica do isolado de MVs microglial constatamos que a microglia ativada secreta proteínas envolvidas em diversas funções biológicas como na plasticidade sináptica, metabolismo, processos celulares e resposta inflamatória, além de neurotransmissores como glutamato. Em conjunto, nossos resultados sugerem que um estímulo pró-inflamatório pelo LPS pode ativar o inflamassomo NLRP3 microglial possibilitando a produção e liberação de IL-1\03B2 e que ROS mitocondrial teria um papel importante neste processo. Em adição, nossos dados sugerem que a ativação do inflamassomo NLRP3 na microglia é associada à produção de MVs, que carregam proteínas e neurotransmissores com potencial impacto nas disfunções sinápticas
Abstract: A dramatic decline in physical, psychological, and cognitive abilities are frequents in sepsis survivors.These functional and cognitive impairments have important social and public health implications. Recent evidences demonstrate that microglial cells participate structurally and functionally on the synaptic microenvironment. However, it is little known how microglial cells are activated and how this activation may contribute to synaptic dysfunction and cognitive loss in systemic inflammation. Thus, this study aimed to investigate the role of microglia in synaptic dysfunction in sepsis. Using a model of polymicrobial peritonitis (cecal ligation and puncture-CLP), we demonstrated that animals exhibit a reduction in the number of excitatory and inhibitory synapses after 24 hours of surgery, identified by colocalization of the synaptophysin/PSD-95 and VGAT/GABAAR, respectively. Synaptic loss was accompanied by neuroinflammation with microglial activation and an increase of the IL-1\03B2 in the hippocampus. To understand cellular and molecular mechanisms underlying in this synaptic loss, we used an in vitro approach where neuron cultures were incubated with conditioned medium derived from cultured microglia (MCM) that were either non-stimulated or stimulated with lipopolysaccharide (MCMLPS). Our results showed that MCM-LPS induced a reduction in the number of neuronal synapses. Furthermore, inhibition of IL-1\03B2 signaling through the addition of a soluble IL-1\03B2 receptor antagonist (IL-1 Ra) prevented the synaptic deficit induced by LPS-MCM We investigated whether the NLRP3 inflammasome activation was involved in the production and release of IL-1\03B2 by microglia. Our results showed that 24 hours after CLP there was an increase in the expression of the NLRP3 inflammasome components, such as the NLRP3 receptor, ASC, caspase-1 enzyme and IL-1\03B2. In addition, by double staining for Iba-1/NLRP3 we observed an increase of the receptor NLRP3 in septic animals that were mostly expressed in microglia. In our in vitro studies, we found that LPS induced the increased levels of NLRP3, active caspase-1, caspase-1/ASC complex and IL-1\03B2 in microglial culture. We also observed that the inhibition of the some factors involved in NLRP3 inflammasome activation, such as the NLRP3 receptor and caspse-1, as well as also mitochondrial ROS inhibitor, interfered in the IL-1\03B2 production by LPS-activated microglia. We also investigated the secretory phenomena associated with NLRP3 inflammasome activation. We observed that the microglia cells released more microvesicles (MV) when activated by LPS. When we analyzed the protein composition from the microglial MV we found that activated microglia release proteins involved in several biological functions such as synaptic plasticity, metabolism, cellular processes and inflammatory response, as well as neurotransmitters such as glutamate. Together our results suggest that a pro-inflammatory stimulus by LPS can activate the NLRP3 microglial inflammasome inducing the production and release of IL-1\03B2. Moreover, mitochondrial ROS plays an important role in this process. Besides that, our data suggest that NLRP3 activation in the microglia is associated with the production of MVs, which carry proteins and neurotransmitters with potential impact on synaptic dysfunctions
keywords: Sepse
Microglia
DeCS: Disfunção Cognitiva
Sepse
Microglia
Issue Date: 2017
Citation: MORAES, Carolina Araújo. Investigação do papel da microglia na disfunção sináptica na sepse. 2017. 121 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular)-Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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