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Title: Identificação e avaliação da imunogenicidade de epítopos de células B de proteínas de esporozoítos (PVCELTOS) e merozoítos (PVMSP-9) de Plasmodium vivax
Advisor: Lima Junior, Josué da Costa
Authors: Silva, Rodrigo Nunes Rodrigues da
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Dentre as espécies causadoras de malária humana, o Plasmodium vivax se destaca como a espécie mais dispersa geograficamente no mundo, resultando em um significativo impacto socioeconômico. Todavia, a falta de um sistema in vitro para o cultivo contínuo, aliado ao equívoco generalizado de que a malária causada pelo P. vivax é branda, têm tornado o desenvolvimento de vacinas candidatas contra P. vivax uma tarefa ainda mais complexa. Por outro lado, a vacinologia reversa surge como uma alternativa promissora, pois através de diferentes ferramentas de bioinformática, é possível identificar potenciais candidatos vacinais com menor custo, tempo e sem a necessidade de uma grande estrutura laboratorial. Desse modo, a determinação de regiões imunogênicas e específicas dentro de candidatas vacinais já estabelecidas também pode ser utilizada na geração de antígenos quiméricos, contendo múltiplos epítopos contra diferentes alvos, levando a um avanço no desenvolvimento de vacinas eficazes. Baseados nesse conceito, nos propomos a identificar in silico epítopos de célula B em proteínas candidatas vacinas de esporozoítos (PvCelTOS) e merozoítos (PvMSP-9) de P. vivax, confirmar sua imunogenicidade natural em populações expostas a malária e avaliar sua antigenicidade e imunogenicidade em modelos animais. (Artigo 1) Primeiramente em relação a proteína PvCelTOS, utilizando a combinação de 3 algoritmos de predição, identificamos 4 potenciais epítopos lineares de célula B nesta proteína. Para confirmar os potenciais epítopos e validar a estratégia utilizada utilizamos o plasma de 528 indivíduos naturalmente expostos a malária. Inicialmente observamos que 17% destes indivíduos apresentavam anticorpos IgG contra a PvCelTOS recombinante com prevalência de anticorpos IgG1 Adicionalmente, utilizando o plasma dos indivíduos respondedores frente a um peptide array composto de 32 peptídeos representando toda a PvCelTOS, confirmamos a presença de 50% dos epítopos indicados pela predição. Estes dados confirmam o êxito de nossa estratégia e corroboram o uso da vacinologia reversa para identificação de epítopos lineares em malária. (Artigo 2) Baseados no estudo anterior, realizamos a análise in silico da PvMSP9, uma candidata vacinal de estágio eritrocítico, identificando a sequência EAAPENAEPVHENA (PvMSP9E795-A808) como um potencial epítopo célula B, que se repete 5 vezes ininterruptas em tandem e corresponde a 29% dos blocos de repetição da proteína, a região mais imunogênica da PvMSP9. A imunogenicidade deste epítopo foi confirmada, pois 56% dos respondedores para a proteína recombinante representando os blocos de repetição da PvMSP9, reconheciam o peptídeo PvMSP9E795-A808. Este epítopo, foi considerado um bom alvo vacinal, pois a reatividade de anticorpos específicos contra o peptídeo PvMSP9E795-A808 foi diretamente correlacionada com o tempo passado desde o último episódio de malária e inversamente associado com o número de episódios recentes da doença. (Artigo 3) Por fim, visando avaliar a imunogenicidade do epítopo PvMSP9E795-A808 em modelos animais, duas repetições desta sequência foram sintetizadas como peptídeos lineares em sua forma simples (RII) e conjugado a epítopos T-helper descritos na PvMSP9 (pLRII) e na toxina-tetânica (TTRII); emulsificados em Montanide ISA-51 e utilizados na imunização de camundongos BALB/c. Todos os peptídeos induziram anticorpos específicos contra o epítopo PvMSP9(E795-V808)2, confirmando sua imunogenicidade os peptídeos conjugados pLRII e TTRII, contendo epítopos T-helper fusionados a sequência RII, induziram maiores títulos de anticorpos que o peptídeo simples, sendo este o primeiro trabalho evidenciando potencial do epítopo pL como epítopo T-helper em camundongos. Considerando que anticorpos anti-PvMSP9 se mostraram capazes de inibir a invasão de merozoiítas in vitro em estudos anteriores, nossos dados corroboram um papel protetor dos anticorpos anti-PvMSP9(E795-A808)2, uma vez que estes reconheceram tanto a proteína recombinante representando os blocos de repetição da PvMSP9, quanto a proteína nativa do parasito. Acerca da resposta celular, apenas o peptídeo TTRII foi capaz de induzir produção de IFN-\03B3, em níveis comparáveis aos induzidos pela PvMSP9 recombinante. Concluindo, nosso estudo reforça o uso da vacinologia reversa como uma alternativa viável para identificar e explorar candidatos vacinais contra o P. vivax, caracterizando seus epítopos e permitindo a elaboração de novas e melhores construções vacinais, baseadas em multi-epítopos.
Abstract: Among the species that cause human malaria, Plasmodium vivax is the most geographically dispersed species in the world, resulting in a significant socioeconomic impact. However, the lack of an in vitro system for continuous culture, associated with the widespread misconception that P. vivax malaria is a mild disease, has made the development of candidate vaccines against P. vivax an even more complex task. On the other hand, reverse vaccinology emerge as a promising alternative, because through different bioinformatics tools, it is possible to identify potential vaccine candidates with low cost, time and without the need of a large laboratory structure. Thus, the determination of immunogenic and specific regions within already established vaccine candidates can also be used in the generation of chimeric antigens, containing multiple epitopes against different targets, leading to an advance in the development of effective vaccines. Based on this concept, we propose to identify in silico B-cell epitopes in sporozoite (PvCelTOS) and merozoite (PvMSP-9) vaccine candidates against P. vivax, confirm their natural immunogenicity in populations exposed to malaria, and assess their antigenicity and immunogenicity in animal models. Article 1: First, in relation to PvCelTOS protein, using the combination of three prediction algorithms, we identified 4 potential linear B cell epitopes in this protein. To confirm the potential epitopes and validate the strategy used we used the plasma of 528 individuals naturally exposed to malaria. Initially, we observed that 17% of these individuals had IgG antibodies against recombinant PvCelTOS with prevalence of IgG1 antibodies Additionally, using the plasma of responders against a peptide array composed of 32 peptides representing the entire PvCelTOS, we confirmed the presence of 50% of the epitopes indicated by the prediction. These data confirm the success of our strategy and corroborate the use of reverse vaccination for the identification of linear epitopes in malaria. Article 2: Based on the previous study, we performed the in silico analysis of PvMSP9, an erythrocytic stage vaccine candidate, identifying the sequence EAAPENAEPVHENA (PVMSP9E795-A808) as a potential B-cell epitope, which is presented as 5 uninterrupted tandem repeats corresponds to 29% of the repetitive region, the most immunogenic region of PvMSP9. The immunogenicity of this epitope was confirmed by ELISA, as 56% of the responders to the recombinant protein representing the replicate blocks of PvMSP9 recognized the peptide PVMSP9E795-A808. This epitope was considered a good vaccine target because the reactivity of specific antibodies against the peptide PvMSP9E795-A808 was directly correlated with the time since the last malaria episode and inversely associated with the number of recent episodes of the disease. Article 3: In order to evaluate the immunogenicity of the PVMSP9E795-A808 epitope in animal models, two replicates of this sequence were synthesized as linear peptides in their simple form (RII) and conjugated to T-helper epitopes described in PvMSP9 (pLRII) and in tetanus toxin (TTRII); emulsified in Montanide ISA-51 and used in the immunization of BALB / c mice. All peptides induced specific antibodies against the epitope PvMSP9 (E795-V808)2, confirming its immunogenicity However, the pLRII and TTRII conjugated peptides, containing T-helper epitopes fused to the RII sequence, induced higher antibody titers than the simple peptide, being this work the first evidence of the potential of pL epitope as T-helper epitope in mice. Considering that anti-PvMSP9 antibodies were shown to inhibit merozoite invasion in vitro in previous studies, our data corroborate a protective role of anti-PvMSP9 (E795-A808) antibodies, since they recognized both the recombinant protein representing the PvMSP9 repeat blocks and the parasite's native protein in Immunofluorescence. Regarding the cellular response, only the TTRII peptide was able to induce IFN-\03B3 production, at levels comparable to those induced by recombinant PvMSP9. In conclusion, our study reinforces the use of reverse vaccinology as a viable alternative to identify and explore vaccine candidates against P. vivax, characterizing its epitopes and allowing the development of new and/or better multi-epitope-based vaccine constructs.
keywords: Malária
Plasmodium Vivax
Imunidade nas Mucosas
Mapeamento de Epitopos
Issue Date: 2017
Citation: SILVA, Rodrigo Nunes Rodrigues da. Identificação e avaliação da imunogenicidade de epítopos de células B de proteínas de esporozoítos (PVCELTOS) e merozoítos (PVMSP-9) de Plasmodium vivax. 2017. 189 f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto Oswaldo Cruz
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Teses de Doutorado

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