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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27779
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE HISTOPLASMA CAPSULATUM ISOLADOS NO BRASIL
Técnica de Amplificação ao acaso de DNA Polimórfico
Filogenia
tipagem
Muniz, Mauro de Medeiros | Date Issued:
2009
Author
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Para estabelecer a relação genética entre isolados de Histoplasma capsulatum brasileiros obtidos de diferentes fontes, um ensaio de reação em cadeia de polimerase utilizando primers arbitrários (PCR-RAPD) foi usado para delinear o polimorfismo entre os isolados de diversas regiões geográficas do Brasil e o RAPD fingerprinting revelou distintos perfis genotípicos promovendo um alto nível de discriminação entre cepas de H. capsulatum de diferentes localidades. Este estudo foi pioneiro na estratificação de isolados de H. capsulatum do Brasil através da tipagem molecular e associação com a sua origem geográfica. Múltiplos métodos de tipagem foram desenvolvidos para estudo epidemiológico de H. capsulatum, porém as informações são limitadas quando comparados os resultados obtidos por metodologias diferentes usando o mesmo grupo de isolados. Para explorar a diversidade de H. capsulatum no Brasil e determinar a correlação entre três técnicas de tipagem molecular diferentes, examinamos 51 isolados de origem (ambiental, animal, e humano) por M13 PCR fingerprinting, PCR-RFLP da região ITS1-5.8S-ITS2 e sequenciamento parcial de quatro genes que codificam proteínas (ARF, H ANTI, OLE, TUB) Cada método identificou três agrupamentos genéticos principais com uma alta concordância entre si. Notavelmente, o método de sequenciamento parcial de gene resultou em altos valores de bootstrap sugerindo que o método apresenta grande sensibilidade. Além disso, análise filogenética dos 51 isolados brasileiros com 19 seqüências de H. capsulatum publicadas em bancos de dados de tais genes demonstrou um agrupamento genético singular, exibindo a natureza complexa e diversa do H. capsulatum. Diferentes métodos moleculares promovem informações complementares que podem conduzir a um entendimento mais amplo de epidemiologia molecular Neste trabalho, investigamos a possibilidade de utilização da técnica de qRT-PCR para quantificar a expressão de genes e elucidar a relação dos isolados brasileiros de H. capsulatum que se agruparam por perfis de PCR-RFLP, M13 DNA fingerprinting e por sequenciamento parcial do gene do antígeno H. Portanto, a expressão de seis genes associados à virulência do H. capsulatum e ficou evidenciado que este método permitiu o agrupamento dos isolados altamente relacionados. Além disso, os resultados sugerem que no modelo H. capsulatum, processos de microevoluções possam estar ocorrendo para possivelmente facilitar sua adaptação a seu ambiente local.
Abstract
To establish the genetic relationship among Histoplasma capsultum isolates obtained from different sources a PCR-based random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay was used to delineate polymorphisms among isolates in geographically diverse regions in Brazil. RAPD fingerprinting revealed distinct DNA profiles and provided a high level of discrimination among H. capsulatum strains from different locations. This study was the first report that stratifies the clusters of H. capsulatum strains from Brazil by molecular typing and associates them with the geographical origin. Multiple typing methods have been developed to study H. capsulatum epidemiology, however there is limited information comparing results obtained from different methodologies using the same set of isolates. To explore the diversity of H. capsulatum in Brazil and determine the correlation between three different molecular typing techniques, we examined 51 environmental, animal, and human isolates by M13 PCR fingerprinting, PCR-RFLP analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region and nucleotide sequence polymorphism of four partial gene coding proteins (ARF, H ANTI, OLE, TUB). Each method identified three major genetic clusters with a high concordance between the results of each typing techniques. Notably, the partial gene sequencing method resulted in high bootstrap values suggesting that the genetic sequencing method has the greatest sensitivity. Furthermore, phylogenic analysis comparing the 51 Brazilian strains with 19 published H. capsulatum sequences of these genes showed unique genetic groups of the pathogenic fungus, demonstrating the complex and diverse nature of H. capsulatum. Different molecular approaches provide complementary information that can lead
to a more complete understanding of molecular epidemiology. In this work we investigated whether quantitative real-time measurements of gene expression - qRT-PCR - could be utilized to dissect the relatedness of Brazilian Histoplasma capsulatum isolates that cluster by PCR-RFLP profiling, M13 DNA fingerprinting and by sequencing of their ITS1-8SITS2
region and H antigen gene. We examined the expression of six genes associated with H. capsulatum virulence and determined that this method allowed for the separation of closely related isolates. Furthermore, the results suggest that H. capsulatum undergoes microevolution to facilitate adaptation to its local environment.
Keywords in Portuguese
HistoplasmaTécnica de Amplificação ao acaso de DNA Polimórfico
Filogenia
tipagem
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