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Title: Caracterização molecular de isolados de Blastocystis sp. de origem humana e animal
Advisor: Levy, Claudia Masini d'Avila
Members of the board: Bóia, Márcio Neves
Oelemann, Walter Martin Roland
Toma, Helena Keiko
Costa, Filipe Anibal Carvalho
Rodrigues, Yara Leite Adami
Authors: Barbosa, Carolina Valença
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Blastocystis sp. é considerado o parasito mais frequentemente encontrado no trato gastrointestinal humano. Elevados percentuais de prevalência são observados nos países em desenvolvimento, atingindo até 100%. Este parasito também tem sido isolado em aves, anfíbios, répteis, insetos e mamíferos. Análises moleculares parciais do gene SSU-RNAr evidenciaram a existência de 17 subtipos, dos quais 10 (ST1-ST9, ST12) são encontrados na população humana e de animais (exceto o ST9). Os demais subtipos são encontrados exclusivamente em animais. Atualmente, poucos estudos sobre a diversidade genética de Blastocystis sp. foram realizados no Brasil. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os isolados de Blastocystis sp. de origem humana e de animais e avaliar o desempenho das reações em cadeia da polimerase (PCR) com alvos dirigidos para regiões parciais do gene SSU-RNAr, espaçador transcrito interno 1-2 e para SSU-RNAr da organela mitocôndria-like na identificação dos subtipos de Blastocystis sp. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de cultivo in vitro, PCR seguido de sequenciamento, PCR subtipo específico, ferramenta BLAST e análise filogenética. Um total de 848 amostras de fezes foram submetidas ao cultivo in vitro. Das 309 (194 de humanos e 115 de animais) amostras positivas na cultura, somente 241 foram amplificadas e sequenciadas por meio da PCR/sequenciamento para o alvo SSU-RNAr. Destas, 191 (139 humanos e 52 animais) sequências foram identificadas como os seguintes subtipos: ST1, ST2, ST4, ST5 e ST8 por meio da pesquisa pela ferramenta BLAST e pela análise filogenética. O ST de um isolado não foi identificado nas análises. Entre as demais sequências, 22 apresentaram picos sobrepostos no eletroferograma e 27 apresentaram uma baixa resolução Para a análise comparativa entre os alvos foram utilizadas 61 amostras previamente identificadas pelo alvo SSU-RNAr. Destas, foram obtidas 59 sequências para o alvo MLO-DNAr, das quais identificamos os ST1-5, ST7, ST8 e 27 para o alvo ITS1-2. Quando comparamos os resultados obtidos com os alvos SSU-RNAr e MLO-DNAr observamos que 17 isolados apresentaram resultados discordantes quanto à identificação dos STs. Além disso, 16 isolados foram caracterizados somente pelo MLO-DNAr, em decorrência da falta de êxito da PCR ou pela baixa resolução das sequências. Em relação ao alvo ITS1-2 não foi possível comparar os resultados, tendo em vista que existem apenas as sequências dos ST1-ST3 e ST7 depositadas no banco público de DNA. As sequências obtidas para este alvo servirão apenas para aumentar o banco dados. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a ocorrência de uma grande diversidade de subtipos de Blastocystis sp. na amostragem estudada, tanto em hospedeiros humanos quanto em animais. Quanto ao ST não identificado, recomenda-se o sequenciamento total do gene SSU-RNAr para confirmar a existência de um novo ST. O ST4 foi identificado pela primeira vez na população brasileira, bem como a identificação de STs em diferentes hospedeiros animais na amostragem analisada. Em relação a análise de variabilidade genética dos STs, foi possível observar que os ST1 e ST3 apresentaram a maior distância genética intra-subtipos, compreendendo 8% e quase 10%, respectivamente seguidos pelo ST2 com proximamente 5%. Os demais subtipos (ST4-ST9), a divergência genética foi inferior a 5%. Ao analisar as 17 cópias do gene 18S de um isolado do ST7 comparando as diferentes regiões que são utilizadas na literatura, verificamos que a variabilidade genética varia de 1 a 3,5%. Desta forma, este estudo contribui para compreensão da epidemiologia molecular e para a diversidade genética de Blastocystis sp. em escala regional e global.
Abstract: Blastocystis sp. is considered the most frequently found parasite in the human gastrointestinal tract. High prevalence percentages are observed in developing countries, reaching 100%. This parasite has also been isolated from birds, amphibians, reptiles, insects and mammals. Molecular analyzes of the partial SSU-RNAr gene evidenced the existence of 17 subtypes, of which 10 (ST1-ST9, ST12) are found in the human and animal population (except ST9). The other subtypes are found exclusively in animals. Currently, few studies on the genetic diversity of Blastocystis sp. were carried out in Brazil. Thus, the present study aims to characterize the Blastocystis sp. isolates from humans and animals and to evaluate the performance of polymerase chain reactions (PCR) with targets directed to partial regions of SSU-RNAr, internal transcript spacer 1-2 and to mitochondrial-like organelle rRNA in the identification of subtypes of Blastocystis sp. To do so, techniques of in vitro culture, PCR followed by sequencing, specific subtype PCR, BLAST tool and phylogenetic analysis were used. A total of 848 stool samples were submitted to in vitro culture. Of the 309 (194 of humans and 115 of animals) positive samples in the culture, only 241 were amplified and sequenced by means of the PCR/sequencing for the SSU-RNAr target. Of these, 191 (139 human and 52 animal) sequences were subtyped as follows: ST1, ST2, ST4, ST5 and ST8 through BLAST research and phylogenetic analysis. The ST of one isolate was not identified in the analyzes. Among the other sequences, 22 presented overlapping peaks on the electropherogram and 27 presented a low resolution. For the comparative analysis between the targets, 61 samples previously identified by the SSU-RNAr target were used. From these, 59 sequences were obtained for the MLO-DNAr target, from which we identified ST1-5, ST7, ST8 and 27 for the ITS1-2 target When we compared the results obtained with SSU-RNAr and MLO-DNAr targets, we observed that 17 isolates presented discordant results regarding the identification of STs. In addition, 16 isolates were characterized only by MLO-DNAr, due to either the lack of success of PCR, or the low resolution of the sequences. In relation to the ITS1-2 target it was not possible to compare the results, considering that there are only the ST1-ST3 and ST7 sequences deposited in the public DNA bank. The sequences obtained for this target will only serve to feed the database. The results obtained in this study reveal the occurrence of a great diversity of subtypes of Blastocystis sp. in the studied sample, in both human and animal hosts. As for unidentified ST, the complete sequencing of the SSU-RNAr gene is recommended to confirm the existence of a new ST. ST4 was identified for the first time in the Brazilian population, as well as the identification of ST in different animal hosts in the analyzed sample. In relation to the genetic variability analysis of STs, it was possible to observe that ST1 and ST3 had the highest intra-subtype genetic distance, comprising 8% and almost 10%, respectively followed by ST2 with approximately 5%. The other subtypes (ST4-ST9), the genetic divergence was less than 5%. By analyzing the 17 copies of the SSU-RNAr gene from an ST7 isolate comparing the different regions that are used in the literature, we found that the genetic variability varies from 1 to 3.5%. Therefore, this study contributes to the understanding of molecular epidemiology and the genetic diversity of Blastocystis sp. on a regional and global scale.
keywords: Epidemiologia Molecular
Variação Genética
Reação em Cadeia da Polimerase
DeCS: Epidemiologia Molecular
Variação Genética
Reação em Cadeia da Polimerase
Issue Date: 2018
Citation: BARBOSA, Carolina Valença. Caracterização molecular de isolados de Blastocystis sp. de origem humana e animal. 2018. 168 f. Tese (Doutorado em biologia celular e molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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