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Title: Infecção pelo vírus Zika de cultura de explantes e células primárias de placenta humana associada a terapia antiviral
Advisor: Souza, Elen Mello de
Members of the board: Pinto, Luzia Maria de Oliveira
Lamas, Marcelo Einicker
Manso, Pedro Paulo de Abreu
Pinheiro, Luiz Carlos da Silva
Garzoni, Luciana
Authors: Torres, Lauana Ribas
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Em 2015, houve um surto da febre do Zika no Brasil e de nascimento de natimorto/bebês com microcefalia e outras desordens neurológicas de mães que foram acometidas pela infecção, levando a associação entre ZIKV e síndrome congênita. Não está claro como o vírus alcança o feto, mas a placenta representa uma importante rota de transmissão, desde que o vírus foi detectado em placentas de mulheres infectadas e de infecções experimentais in vivo e in vitro. Além desta lacuna no conhecimento da transmissão, ainda não existe tratamento profilático e/ou terapêutico específico para pacientes e, em especial para gestantes infectadas. Desta forma, o objetivo do trabalho foi implementar o cultivo primário de explantes e células de placenta humana a termo, a fim de investigar a susceptibilidade e o perfil de infecção pelo ZIKV ex vivo, e utilizar este modelo experimental para investigar, no contexto de reposicionamento de drogas, a atividade antiviral do fármaco Nitazoxanida (NTZ). Para isto, foi utilizada a membrana fetal e vilosidade coriônica, marcadas por anticorpos característicos para fenotipagem de células placentárias, como a citoqueratina-7 (CK-7) em células epiteliais e vimentina que exclui este tipo celular. Foi observado que os explantes em cultivo apresentaram integridade morfológica, estrutural e fenótipo característicos. A membrana e vilosidade coriônica foram susceptíveis a infecção, sendo que nas vilosidades a infecção ocorreu somente em células vimentina+. O isolamento das células da membrana fetal revelou maior rendimento e viabilidade das células amnióticas comparada às coriônicas. As células amnióticas mantêm sua homogeneidade morfológica e fenotípica CK-7+ em 98% da cultura, enquanto, as coriônicas apresentam uma cultura mista variando de 72% a 28% de células CK-7+, de acordo com o rendimento de sua obtenção, podendo atingir 100% de vimentina+ ao longo do cultivo O isolamento das células das vilosidades coriônicas foi realizado a partir de explantes que se reorganizaram em esferóides formados por cerca de 30% de células CK-7+ e 60% vimentina+, embora em perfis diferentes, as células proliferativas que formaram a monocamada foram susceptíveis a infecção, esses resultados necessitam ser melhor explorados. Quando células aminióticas e coriônicas vimentina+ e CK+ foram infectadas com baixa multiplicidade de infecção (MOI 1) em diferentes tempos, os resultados demonstraram que amnion CK-7+ foram mais susceptíveis. Empregando alta carga viral (MOI 10 e 20) na cinética de infecção de células coriônicas foram observados elevados percentuais de infecção tempo-dependente (17% a 80%), porém, quando comparada a infecção com MOI 20 por 48h de células coriônicas vimentina + e CK-7+ os percentuais alcançados foram cerca de 56% e 77%, respectivamente, demonstrando que células CK+ foram mais susceptíveis a infecção. A análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão das células coriônicas não infectadas demonstrou preservação ultraestrutural. No entanto, a infecção destas células levou a importantes alterações ultraestruturais, especialmente alargamento e formação de estruturas de membrana no retículo endoplasmático, com presença de partículas virais. Importantemente, foi determinada a atividade antiviral do fármaco Nitazoxanida sobre culturas de células coriônicas CK+ infectadas com alta carga viral (MOI 20) por 48h, avaliando redução de células infectadas por detecção antigênica, redução do efeito citopático por ensaio de plaque e redução de carga viral por RT-qPCR Foi observado que a concentração de 50 \03BCg/mL do fármaco levou a redução de 79% de células infectadas, 100% do efeito citopático e cerca de 93% do número de cópias de RNA viral/mL no sobrenadante das culturas tratadas. Com o desenvolvimento deste trabalho, reforçamos que este modelo experimental representa uma excelente ferramenta para explorar aspectos biológicos da transmissão congênita pelo ZIKV e identificar moléculas antivirais, incluindo reposicionamento de drogas, especialmente para o tratamento de gestantes infectadas.
Abstract: In 2015, there was an outbreak of Zika fever in Brazil and birth of stillbirth / infants with microcephaly and other neurological disorders of mothers who were affected by the infection, leading to the association between ZIKV and congenital syndrome. It is unclear how the virus reaches the fetus, but the placenta represents an important route of transmission since the virus was detected in placentas of infected women and experimental infections in vivo and in vitro. Besides this lack of knowledge of the transmission, there is still no specific prophylactic and / or therapeutic treatment for patients and, especially for infected pregnant women. In order to investigate the susceptibility and profile of infection by ZIKV ex vivo, and to use this experimental model to investigate, in the context of repositioning of drugs, the antiviral activity of the drug Nitazoxanide (NTZ). For this, the fetal membrane and chorionic villi were used, marked by antibodies characteristic for phenotyping of placental cells, such as cytokeratin-7 (CK-7) in epithelial cells and vimentin that excludes this cell type. It did observed that the explants in culture showed characteristic morphological, structural and phenotypic integrity. Chorionic membrane and villi were susceptible to infection, but the infection in the villi only occurred in vimentin+ cells Isolation of fetal membrane cells revealed higher yield and viability of amniotic cells compared to chorionic. Amniotic cells maintain their morphological and phenotypic CK-7+ homogeneity in 98% of the culture, while the chorionic cultures show a mixed culture ranging from 72% to 28% of CK-7+ cells, according to their yield, reaching 100% vimentin+ throughout the culture. Isolation of chorionic villus cells was performed from explants that reorganized into spheroids formed by about 30% CK-7+ cells and 60% vimentin+, although in different profiles, the proliferative cells that formed the monolayer were susceptible to infection, these results need to be better explored. When aminiotic and chorionic vimentin+ and CK+ cells were infected with low multiplicity of infection (MOI 1) at different times, the results demonstrated that amnion CK-7+ were more susceptible. Using a high viral load (MOI 10 and 20) in infection kinetics of chorionic cells, high percentages of time-dependent infection were observed (17% to 80%), however, when compared to infection with MOI 20 for 48h of vimentin+ and CK-7+ chorionic cells the percentages reached were about 56% and 77%, respectively, demonstrating that CK+ cells were more susceptible to infection Transmission Electron Microscopy analysis of uninfected chorionic cells demonstrated ultrastructural preservation. However, infection of these cells led to important ultrastructural changes, especially enlargement and formation of membrane structures in the endoplasmic reticulum, with the presence of viral particles. Importantly, antiviral activity of the drug NTZ was determined on cultures of CK+ chorionic cells infected with high viral load (MOI 20) for 48h, evaluating reduction of infected cells by antigenic detection, reduction of cytopathic effect by plaque assay and reduction of viral load by RT-qPCR. It did observed that the concentration of 50 \03BCg/mL of the drug led to the reduction of 79% of infected cells, 100% of the cytopathic effect and about 93% of the number of viral RNA copies / ml in the supernatant of the treated cultures. With the development of this study, we reinforce that this experimental model represents an excellent tool to explore biological aspects of congenital transmission by ZIKV and to identify antiviral molecules, including drug repositioning, especially for the treatment of infected pregnant women.
keywords: Placenta
Zika virus
Células-Tronco
DeCS: Células-Tronco
Issue Date: 2018
Citation: TORRES, Lauana Ribas. Infecção pelo vírus Zika de cultura de explantes e células primárias de placenta humana associada a terapia antiviral. 2018. 119 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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