Infecção pelo vírus Zika de cultura de explantes e células primárias de placenta humana associada a terapia antiviral

Abstract

Em 2015, houve um surto da febre do Zika no Brasil e de nascimento de natimorto/bebês com microcefalia e outras desordens neurológicas de mães que foram acometidas pela infecção, levando a associação entre ZIKV e síndrome congênita. Não está claro como o vírus alcança o feto, mas a placenta representa uma importante rota de transmissão, desde que o vírus foi detectado em placentas de mulheres infectadas e de infecções experimentais in vivo e in vitro. Além desta lacuna no conhecimento da transmissão, ainda não existe tratamento profilático e/ou terapêutico específico para pacientes e, em especial para gestantes infectadas. Desta forma, o objetivo do trabalho foi implementar o cultivo primário de explantes e células de placenta humana a termo, a fim de investigar a susceptibilidade e o perfil de infecção pelo ZIKV ex vivo, e utilizar este modelo experimental para investigar, no contexto de reposicionamento de drogas, a atividade antiviral do fármaco Nitazoxanida (NTZ). Para isto, foi utilizada a membrana fetal e vilosidade coriônica, marcadas por anticorpos característicos para fenotipagem de células placentárias, como a citoqueratina-7 (CK-7) em células epiteliais e vimentina que exclui este tipo celular. Foi observado que os explantes em cultivo apresentaram integridade morfológica, estrutural e fenótipo característicos. A membrana e vilosidade coriônica foram susceptíveis a infecção, sendo que nas vilosidades a infecção ocorreu somente em células vimentina+. O isolamento das células da membrana fetal revelou maior rendimento e viabilidade das células amnióticas comparada às coriônicas. As células amnióticas mantêm sua homogeneidade morfológica e fenotípica CK-7+ em 98% da cultura, enquanto, as coriônicas apresentam uma cultura mista variando de 72% a 28% de células CK-7+, de acordo com o rendimento de sua obtenção, podendo atingir 100% de vimentina+ ao longo do cultivo O isolamento das células das vilosidades coriônicas foi realizado a partir de explantes que se reorganizaram em esferóides formados por cerca de 30% de células CK-7+ e 60% vimentina+, embora em perfis diferentes, as células proliferativas que formaram a monocamada foram susceptíveis a infecção, esses resultados necessitam ser melhor explorados. Quando células aminióticas e coriônicas vimentina+ e CK+ foram infectadas com baixa multiplicidade de infecção (MOI 1) em diferentes tempos, os resultados demonstraram que amnion CK-7+ foram mais susceptíveis. Empregando alta carga viral (MOI 10 e 20) na cinética de infecção de células coriônicas foram observados elevados percentuais de infecção tempo-dependente (17% a 80%), porém, quando comparada a infecção com MOI 20 por 48h de células coriônicas vimentina + e CK-7+ os percentuais alcançados foram cerca de 56% e 77%, respectivamente, demonstrando que células CK+ foram mais susceptíveis a infecção. A análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão das células coriônicas não infectadas demonstrou preservação ultraestrutural. No entanto, a infecção destas células levou a importantes alterações ultraestruturais, especialmente alargamento e formação de estruturas de membrana no retículo endoplasmático, com presença de partículas virais. Importantemente, foi determinada a atividade antiviral do fármaco Nitazoxanida sobre culturas de células coriônicas CK+ infectadas com alta carga viral (MOI 20) por 48h, avaliando redução de células infectadas por detecção antigênica, redução do efeito citopático por ensaio de plaque e redução de carga viral por RT-qPCR Foi observado que a concentração de 50 \03BCg/mL do fármaco levou a redução de 79% de células infectadas, 100% do efeito citopático e cerca de 93% do número de cópias de RNA viral/mL no sobrenadante das culturas tratadas. Com o desenvolvimento deste trabalho, reforçamos que este modelo experimental representa uma excelente ferramenta para explorar aspectos biológicos da transmissão congênita pelo ZIKV e identificar moléculas antivirais, incluindo reposicionamento de drogas, especialmente para o tratamento de gestantes infectadas.