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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/37362
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DissertationCopyright
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2021-07-09
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OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LEISHMANIA INFANTUM DEFICIENTE PARA O GENE LPG2
Santos, Flávio Henrique | Date Issued:
2019
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Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: O glicoconjugado LPG é uma das moléculas dominantes na superfície do estágio de promastigota de Leishmania. Este fator de virulência multifuncional participa em uma variedade de processos durante o estabelecimento da infecção no hospedeiro mamífero. Além do LPG, esses protozoários possuem em sua superfície outras moléculas como os PPGs,PGs e sAP que contribuem para a sobrevivência da Leishmania dentro da célula hospedeira,Umas das enzimas essenciais para síntese do LPG e destas outras moléculas contendo fosfoglicanos (PGs) em sua estrutura é a GDP-manose transferase que é codificada pelo gene LPG2. OBJETIVOS: Caracterizar a estrutura do gene LPG2 no genoma de L. infantum (MCAN/BR/89/BA262). Obter parasitas lpg2-/- e caracteriza-los molecularmente e avaliar sua virulência em ensaios de infecção de macrófagos in vitro. MÉTODOS: A edição do genoma foi realizada utilizando o método clássico de recombinação homóloga com marcadores de resistência a antibióticos, e posteriormente com o sistema CRISPR/Cas9. Os parasitas nocautes foram selecionados utilizando ensaios de aglutinação com anticorpo CA7AE e com a lectina (RCA 120). RESULTADOS: O processo de obtenção dos parasitas nocautes por recombinação homóloga se demonstrou inviável devido a presença de uma cópia adicional do gene LPG2 no genoma de L. infantum que não havia sido descrita anteriormente. Esse resultado nos levou a utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para a interrupção do gene LPG2 nesta espécie. Cinco clones foram isolados após as etapas de seleção utilizando o anticorpo CA7AE e posteriormente a lectina (RCA 120). Os resultados obtidos com o sequenciamento mostraram a ocorrência da edição esperada no genoma em todos os clones. Além disso, o resultado do Western blot mostrou a perda completa da expressão do LPG e de PGs. Os resultados de curvas de crescimento mostram que todos os clones lpg2-/- apresentam um fenótipo (morfologia) e uma taxa de crescimento similar, sugerindo a ausência de efeitos de edição inespecíficos “offtargets”. Ensaios preliminares de infecção de macrófagos murinos in vitro utilizando os parasitas lpg2-/-, demonstram uma redução na taxa de infecção (4h - 34,5% e 72h - 34,6%) além de uma diminuição na carga parasitária (4h - 46,2% e 72h - 49,9%). CONCLUSÃO: O gene LPG2 está duplicado em L. infantum e foi nocauteado com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Os dados dos ensaios de infecção reforçam a importância do LPG e outros PGs como fatores de virulência na interação parasito-hospedeiro.
Abstract
Lipophosphoglycan glycoconjugate (LPG) is one of the dominant
molecules on the surface of the Leishmania promastigote stage. This multifunctional virulence factor participates in a variety of processes during the establishment of infection in the mammalian host. In addition to LPG, these protozoa have on their surface other molecules, e.g.
Proteophosphoglycans (PPGs), free phosphoglycan polymers (PGs) and acid phosphatases (sAP), which contribute to the survival of Leishmania within the host cell by modulating signaling of macrophages. One essential enzymes for the synthesis of LPG and other phosphoglycan (PG) containing molecules is the GDP-mannose transferase, which is encoded by the LPG2 gene. OBJECTIVES: Characterize the genomic structure the LPG2 gene in L. infantum (MCAN/BR/89/BA262). Generate lpg2-/- parasites, provide their molecular characterization and finally assess their virulence in vitro macrophages infection assays. METHODS: Genome editing was performed using the classical homologous recombination procedures by using antibiotic resistance genes as markers, and later on with the CRISPR/Cas9 system. Knockouts parasites were screened by agglutination assays using CA7AE antibody and subsequently the lectin (RCA 120). RESULTS: The process of obtaining knockout parasites by homologous recombination was unsuccessful due to the presence of an additional copy of the LPG2 gene in the L. infantum genome, which has not been previously described. This result led us to use the CRISPR/Cas9 system for LPG2 gene disruption in this species. Six clones were isolated following the screening steps using CA7AE antibody and then lectin (RCA 120). The sequencing results demonstrated the occurrence of the expected genome edition in all clones. In addition, the Western blot results revealed complete loss of LPG and PG expression. Growth curve assays demonstrated that all lpg2-/- clones present similar growth rates, suggesting the absence of off-target effects. Preliminary assays of murine macrophages infection by lpg2-/- parasites demonstrated a reduction in infection rate (4h - 34,5% e 72h - 34,6%), as well as in parasite load (4h - 46,17% e 72h - 49,88%). CONCLUSION: The gene LPG2 is duplicated in L. infantum and was successfully knocked out using the CRISPR/Cas9 system. The results obtained herein reinforce the importance of LPG and other PGs as virulence factors in host-parasite interactions.
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