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Title: Desenvolvimento de uma PCR multiplex capaz de detectar e classificar cepas de Trypanosoma cruzi em amostras clínicas e de campo
Other Titles: Development of a PCR multiplex capable to detect and to classify cepas of Trypanosoma cruzi in clinical samples and field
Advisor: Romanha, Alvaro José
Murta, Silvane Maria Fonseca
Authors: Liarte, Daniel Barbosa
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: Nesse trabalho, descrevemos a busca por marcadores moleculares que permitam simultaneamente o diagnóstico da doença de Chagas e a classificação das cepas segundo o fenótipo de susceptibilidade a drogas, zimodema e/ou grupos I e II do T. cruzi. Inicialmente, selecionamos seqüências repetitivas do DNA do T. cruzi e iniciadores descritos para o diagnóstico da doença de Chagas. Analisamos as seqüências do elemento repetitivo E13, kDNA e o DNA satélite (195 pb). Os resultados com o elemento repetitivo E13 e seqüências do kDNA, mostraram uma grande variabilidade dessas seqüências, inviabilizando a busca de marcadores. Analisamos 160 seqüências do DNA satélite de 195 pb de 12 cepas do T. cruzi previamente caracterizadas segundo o fenótipo de susceptibilidade a drogas e zimodema. Estudos de filogenia mostraram a existência de dois grupos distintos, associados com os grupos I e II do T. cruzi. Observamos a presença de 8 polimorfismos exclusivos das cepas do grupo I do T. cruzi. Desenhamos iniciadores específicos para estes polimorfismos. Um sistema de PCR multiplex constituído pelos iniciadores TcSat 4 e Diaz 7 e 8 permitiram a classificação das cepas de T. cruzi nos grupos I e II. A sensibilidade foi de 10 fg, o que corresponde a 1/30 do DNA de um parasito. Amostras de DNA de outros tripanosomatídeos não produziram produto amplificado. Comparamos o perfil de amplificação do DNA satélite de 30 cepas de T. cruzi e 24 amostras de sangue de camundongos experimentalmente infectados com as cepas Colombiana (grupo I) e Y (grupo II) em papel de filtro. Em todas as amostras positivas foi possível a identificação dos grupos I e II. Para validarmos a técnica com amostras de campo, utilizamos 7 amostras de DNA do creme leucocitário de pacientes na fase aguda da doença de Chagas e 15 amostras de fezes de Triatoma infestans em papel de filtro. As amostras de pacientes foram grupo II e as amostras de T. infestans grupo I. Esses resultados estão de acordo com os dados descritos na literatura que mostram uma associação entre cepas do grupo I do T. cruzi e o ciclo silvestre do parasito e entre cepas do grupo II e o ciclo doméstico. O PCR multiplex que desenvolvemos permite a classificação das cepas nos dois grupos principais de T. cruzi sem, entretanto correlacioná-las à resistência a drogas. Apresentamos uma metodologia sensível, específica e rápida que poderá ser utilizada em amostras clínicas e de campo como ferramenta de diagnóstico molecular e classificação das cepas de T. cruzi.
Abstract: In the present work, we describe our search for molecular markers that allow the diagnosis of Chagas’ disease and strain classification simultaneously according to the drug susceptibility, zymodeme and/or groups I and II of T. cruzi. We selected DNA repetitive sequences from T. cruzi and primers described previously for diagnosis of Chagas’ disease. We analyzed the sequences of the repetitive element E13, kDNA and satellite DNA (195 bp). The sequences of the repetitive element E13 and the kDNA were highly variable, making unfeasible the search for molecular markers. Polymorphism of the 160 satellite DNAs (195 bp) from 12 T. cruzi strains from different zymodemes and BZ susceptibility were determined. Phylogenetic studies showed the existence of two groups of sequences, associated with the groups I and II of T. cruzi. The existence of 8 polymorphisms exclusive to T. cruzi I strains, lead us to design specific primers for these polymorphisms. A system of PCR multiplex using primers TcSat 4, Diaz 7 and 8, allowed the strain classification of T. cruzi in the groups I and II. The sensibility was of 10 fg, that corresponds at 1/30 of the DNA of one parasite. This PCR multiplex was T. cruzi specific, did not amplifying DNA from other tripanosomatids. We compared the amplification of satellite DNA of 30 T. cruzi strains and 24 blood samples from mice experimentally infected with the Colombian (group I) and Y (group II) strains in filter paper. The samples were classified in groups I and II. In order to validate the technique with field samples, we used 7 samples of Buffy coat DNA from patients in the acute phase of Chagas’ disease, and 15 samples from naturally infected Triatoma infestans feces collected in filter paper. The patients' samples were group II and the samples of T. infestans group I. Our results are consistent with the data described in the literature that show an association between strains of T. cruzi I and the Sylvatic cycle of the parasite and between strains of T. cruzi II and the domestic cycle. The PCR multiplex that we developed allows the T. cruzi DNA detection and the strain classification without correlating them to drug resistance. We presented a sensitive, specific and a fast methodology that can be used in clinical and field samples, as a tool for molecular diagnosis and strain classification of T. cruzi simultaneously.
keywords: Reação em Cadeia da Polimerase
Trypanosoma cruzi
PCR multiplex
Diagnóstico
Classificação
Issue Date: 2006
Citation: LIARTE, Daniel Barbosa. Desenvolvimento de uma PCR multiplex capaz de detectar e classificar cepas de Trypanosoma cruzi em amostras clínicas e de campo. 2006. 135 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)-Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)-Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2006.
Place of defense: Belo Horizonte/MG
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Dissertações de Mestrado

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