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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/5077
DIAGNÓSTICO PALEOPARASITOLÓGICO MOLECULAR DE ASCARIS LUMBRICOIDES (LINNAEUS, 1758)
Souza, Daniela Leles de | Date Issued:
2007
Alternative title
Paleoparasitological molecular diagnosis of Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758)Author
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
O parasito humano Ascaris lumbricoides tem distribuição cosmopolita sendo o mais
prevalente dos helmintos intestinais. Estudos paleoparasitológicos por microscopia ótica
revelaram também que é um dos mais encontrados em material antigo. No entanto são raros os
achados desse parasito na América do Sul pré-colombiana. O objetivo desse estudo foi
estabelecer uma metodologia de diagnóstico paleoparasitológico molecular de A. lumbricoides
que possa ser aplicado diretamente a ADN antigo extraído de coprólitos provenientes de sítios
arqueológicos. Inicialmente a metodologia foi padronizada em amostras fecais atuais positivas
para A. lumbricoides e/ou outros helmintos e ovos isolados a fim de testar a sensibilidade e
especificidade dos métodos diagnósticos. Aos ovos, dois tratamentos foram empregados na
extração de ADN: físico (choque térmico) e físico-químico (choque térmico e fenol-clorofórmio).
Para as amostras fecais foram usados quatro tratamentos: químico (fenol-clorofórmio), Kit
comercial QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen), físico-químico e físico-Kit (choque térmico e
Kit comercial). Dois alvos moleculares, o mitocondrial cit b e o nuclear ITS 1, foram usados.
Ambos os tratamentos físico e físico-químico disponibilizaram ADN suficiente para a PCR
usando-se apenas um ovo para os dois alvos moleculares. O tratamento físico foi essencial para
extração de ADN das amostras fecais. O ensaio do RFLP mostrou o perfil esperado para A.
lumbricoides. Todas as seqüências nucleotídicas de cit b obtidas dos isolados brasileiros
revelaram o nucleotídeo T na posição 5522 característico da espécie A. lumbricoides. Para região
ITS 1, 4/5 seqüências nucleotídicas correspondem ao genótipo G1, o mais prevalente na espécie
humana. Foram depositadas as primeiras seqüências de A. lumbricoides da América do Sul, assim
como este é o primeiro diagnóstico molecular para esse parasito a partir de amostras fecais. As
metodologias utilizadas mostram-se aptas em recuperar ADN do parasito a partir dos coprólitos
experimentais. Os resultados do RFLP e sequenciamento nucleotídico mostraram que o processo
de dessecação artificial não afetou as seqüências nucleotídicas. No trabalho com material
arqueológico, as estratégias como PCR reconstrutiva e reamplificação foram essenciais para as
amplificações. O diagnóstico paleoparasitológico molecular identificou o parasito em 5 amostras
procedentes de sítios arqueológicos sul americanos datados do período pré-colombiano que o
exame por microscopia ótica não havia diagnosticado. Todas as 16 seqüências nucleotídicas de
cit b obtidas revelaram o nucleotídeo característico da espécie A. lumbricoides, sendo que a
maioria das seqüências difere das modernas, afastando a possibilidade de contaminação. Os
resultados do diagnóstico paleoparasitológico molecular mostraram uma mudança na
paleodistribuição do parasito na América do sul, onde este se estende desde o nordeste de Brasil
até o norte do Chile, sendo o achado mais antigo datado de 8800 AP. Pela primeira vez é feito
diagnostico molecular de A. lumbricoides diretamente de coprólitos.
Abstract
Ascaris lumbricoides human infection is distributed all over the world. It is the most
prevalent of all intestinal helminths. The same high prevalences seemed to have occurred in the
past, as evidenced by paleoparasitological data. A. lumbricoides eggs are commonly found in Old
World archaeological material. However, the findings of this parasite in pre-Columbian South
American material are rare. The goal of this study is to establish a methodology to identify A.
lumbricoides infection by DNA extraction from coprolites. Positive fresh samples for A.
lumbricoides and/or other helminth eggs were used to establish a standard methodology.
Sensitivity and specificity were tested using isolated A. lumbricoides eggs. Two treatments were
used to DNA extraction from eggs: physical (boiling/freezing) and physical-chemical
(boiling/freezing and phenol-chloroform). For fecal samples, four treatments were used: chemical
(phenol-chloroform), commercial Kit QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen), physicalchemical and physical-Kit (boiling/freezing and commercial Kit). Two molecular targets, the
mitochondrial cit b and nuclear ITS 1, were used. Both treatments, physical and physicalchemical resulted in DNA amounts sufficient to yield PCR amplifications of a single egg using
both molecular targets. The physical treatment was essential for DNA extraction from fecal
samples. RFLP assay resulted in the profile described for A. lumbricoides. All the nucleotide
sequences of cit b of the Brazilian isolates have the nucleotide T at position 5522, characteristic
of A. lumbricoides species. For the region ITS 1, 4/5 nucleotide sequences correspond to the
genotype G1, the most prevalent in humans. The first A. lumbricoides sequences found in South
America were deposited in the GenBank. It is also the first time that molecular diagnosis is used
for this parasite in fecal samples. The methodologies used were able to extract parasite DNA
from experimental coprolites. Nucleotide sequences were not affected by experimental
desiccation, as showed by RFLP and nucleotide sequencing. The strategies of reconstructive PCR
and reamplification were essential for PCR amplifications, when applying in archaeological
material. The paleoparasitological molecular diagnosis identified the parasite in five human
coprolites collected in South American archaeological sites dated of pre-Columbian times. All
five samples were negative under microscopic examination. All the 16 nucleotide sequences of
cit b have the characteristic nucleotide of A. lumbricoides specie. The most ancient sequences
recovered differ from the modern ones, excluding the possibility of contamination. The results of
paleoparasitological molecular diagnosis changed the paleodistribuition of the parasite, showing
that A. lumbricoides infection was present since 8800 BP in South America, from the northeast of
Brazil to north of Chile. For the first time was demonstrated the recovery of A. lumbricoides
aDNA straight from coprolites.
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