Comparação da acurácia entre as técnicas de hibridização in situ colorimétrica, histopatologia, imuno-histoquímica e qPCR para diagnóstico de Leishmaniose tegumentar americana causada por Leishmania braziliensis em amostras de pele

Abstract

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma antropozoonose causada por diferentes espécies do protozoário do gênero Leishmania que ocorrem no Novo Mundo e causam lesões na pele e/ou mucosas de vias aéreas superiores de humanos e outros mamíferos. O diagnóstico acurado é importante, uma vez que os fármacos utilizados no tratamento possuem elevada toxicidade. Um método alternativo e promissor para detecção sensível e específica de formas amastigotas de Leishmania em tecidos fixados com formol a 10% e emblocados em parafina (FFEP) é a técnica de hibridização in situ colorimétrica (CISH). O objetivo desse estudo é comparar a acurácia da técnica de CISH com dois métodos de imuno-histoquímica, histopatologia e qPCR para o diagnóstico de LTA causada por Leishmania braziliensis em amostras de pele com lesão FFEP. Foi desenhada uma sonda de oligonucleotídeos para CISH visando detecção específica de L. braziliensis. Amostras teciduais FFEP obtidas de lesões cutâneas de pacientes com LTA causada por L. braziliensis foram examinadas pelas técnicas de CISH, histopatologia (HP), imuno-fosfatase alcalina (IFA), imuno-peroxidase (IP) e qPCR. Essas amostras foram provenientes de 62 pacientes com diagnóstico de LTA confirmado pelo isolamento em cultura e caracterização isoenzimática de L. braziliensis (coletadas no período de 2000 a 2005) e de 45 pacientes com diagnóstico negativo para LTA na cultura parasitológica e positivo para Sporothrix sp. na cultura fúngica (coletadas no período de 2013 a 2015). As técnicas de IP, IFA e CISH também foram testadas em outras espécies de Leishmania diferentes de L. braziliensis e fungos patogênicos para verificação de reação ou hibridização cruzada Adicionalmente, foram incluídas 31 amostras teciduais FFEP obtidas de lesões cutâneas de pacientes com LTA causada por L. braziliensis (coletadas no período de 2020 a 2021) para avaliação da sensibilidade da CISH em amostras mais recentes. As sensibilidades da IFA, IP, HP, CISH (amostras de 2020 e 2021), CISH (amostras de 2002 a 2005), qPCR 18S e qPCR HSP70 foram 84%, 77%, 71%, 52%, 44%, 31% e 21%, respectivamente. A especificidade de todas as técnicas foi 100%, com exceção da IP com 93%. As acurácias da IFA, IP, HP, CISH, qPCR 18S e qPCR HSP70 foram 91%, 84%, 83%, 67%, 60% e 54%, respectivamente. Na CISH não houve reação cruzada com fungos causadores de lesões cutâneas e com outras espécies de Leishmania diferentes de L. braziliensis testadas, exceto L. guyanensis. Por sua vez, na IFA e IP houve reação cruzada com fungos patogênicos e todas as espécies de Leishmania diferentes de L. braziliensis testadas. A concordância inter observador foi substancial para CISH (amostras 2020 a 2021), moderada para CISH (amostras 2002 a 2005), HP e IFA e razoável para IP. Os resultados confirmam a CISH como um método específico para o diagnóstico da infecção por LTA causada por L. braziliensis e L. guyanensis em biópsias de lesão cutâneas FFEP, que pode ser implementada na rotina laboratorial para confirmação dos casos suspeitos de LTA por IP, IFA ou HP. Pela sua melhor acurácia, recomenda-se a utilização preferencial da IFA em comparação com a IP para o diagnóstico de LTA. Pela sua baixa sensibilidade, não é recomendada a utilização da qPCR 18S e HSP70 para diagnóstico da LTA em amostras FFEP com mais de 17 anos de armazenamento