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Title: Avaliação do papel da proteína NS3 do vírus da dengue na proteção ou patogênese em camundongos
Advisor: Alves, Ada Maria de B.
Members of the board: Pirmez, Claude
Santos, Cláudia Nunes Duarte dos
Meis, Juliana de
Almeida, Cecília J. G. de
Santos, Flávia Barreto dos
Authors: Santos, Anna Paula Yorio dos
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A dengue é considerada uma das mais importantes arboviroses humanas, sendo causa de morbidade e mortalidade na maioria das regiões tropicais e subtropicais do mundo. Os sintomas da doença variam desde a febre do dengue até a febre hemorrágica e síndrome do choque. O desenvolvimento de uma vacina contra dengue, que confira imunidade protetora de longa duração contra os quatro sorotipos, é uma das prioridades da Organização Mundial da Saúde (OMS). Porém, tais estudos esbarram em algumas dificuldades, entre elas a pouca compreensão da patogênese da doença principalmente no que diz respeito aos casos mais graves. Algumas evidências apontam a proteína não estrutural 3 (NS3) de dengue como antígeno protetor, por um lado, enquanto outras sugerem que esta proteína está relacionada à patogênese da doença. Sendo assim, este trabalho visa avaliar o efeito da expressão da proteína NS3 em camundongos utilizando vacinas de DNA, no que concerne à proteção e/ou patogênese da dengue, e estudar as respostas imunes envolvidas nestes processos. Inicialmente, a capacidade protetora da NS3 inteira ou somente seus domínios funcionais (protease e helicase) foi avaliada em animais vacinados e desafiados com vírus da dengue sorotipo 2 (DENV2). Observamos que 90% e 80% dos animais imunizados com os plasmídeos baseados na NS3 inteira, pcTPANS3 e pcNS3, respectivamente, sobreviveram ao desafio. Entretanto, 40% e 60% destes camundongos apresentaram sinais clínicos da doença. Nos animais imunizados com os plasmídeos que codificam a helicase (pcTPANS3H e pcNS3H), a taxa de sobrevivência foi de aproximadamente 75%, enquanto que os plasmídeos que codificam a região da protease (pcTPANS3P ou pcNS3P) não foram capazes de conferir proteção aos animais. Posteriormente, avaliamos o efeito das imunizações com alguns destes plasmídeos no tecido hepático dos animais não infectados com DENV, e detectamos áreas focais com hemorragia e edema, que foram maiores em animais inoculados com plasmídeos que codificam a proteína NS3 inteira ou a porção helicase. Foram observados, também, danos no parênquima e aumento dos níveis séricos da enzima hepática alanina aminotransferase (ALT) em animais imunizados com o plasmídeo que codifica a porção protease da NS3. Apesar dos focos de edema e hemorragia, não foram detectadas alterações de permeabilidade vascular no fígado ou em outros órgãos analisados de animais inoculados com os plasmídeos que codificam a proteína NS3 inteira. Os animais infectados com DENV2 por via intra-cerebral (i.c.) apresentaram alterações vasculares no baço, fígado, estômago e rins no período do aparecimento dos sinais clínicos da infecção. A ocorrência de danos no fígado de animais que expressam a proteína inteira foi acompanhada de aumento de células T iii CD8+ neste órgão, além do aumento de células T CD4+ e T CD8+ ativadas no sangue, detectadas por citometria de fluxo. Além disso, foi observada uma resposta imune celular com produção de interferon gamma (IFN-γ) em esplenócitos provenientes destes animais, após estímulo com um peptídeo presente na NS3 e descrito como imunogênico para camundongos Balb/c. Portanto, os resultados sugerem a participação de uma resposta imune celular no mecanismo de proteção induzido pelas vacinas de DNA baseadas na NS3 nos testes de desafio com DENV por via i.c.. Contudo, esta resposta pode estar envolvida também na indução dos danos hepáticos observados nos animais imunizados.
Abstract: Dengue is considered one of the most important human arboviruses diseases, causing morbidity and mortality in most tropical and subtropical regions of the world. The disease symptoms range from dengue fever to dengue hemorrhagic fever and shock syndrome. The development of a dengue vaccine that confers long-term protective immunity against all four serotypes is one of the priorities of world health organization (WHO). However, such studies face some difficulties, such as the poor understanding of the disease pathogenesis, especially in severe cases. Some evidences point that the dengue nonstructural protein 3 (NS3) is a protective antigen, while other suggest that this protein is involved in the pathogenesis of the disease. Therefore, this work aims to evaluate the effect of the NS3 protein expression in mice using DNA vaccines, regarding protection and/or the pathogenesis of dengue and also to study the immune responses involved in these processes. Initially, the protective role of the full-length NS3 or its functional domains (protease and helicase) was evaluated in vaccinated mice challenged with dengue 2 virus (DENV2). We observed that 90% and 80% of the animals immunized with plasmids based on the full-length NS3, pcTPANS3 and pcNS3, respectively, survived the challenge. However 40% and 60% of these mice showed clinical signs of the disease. In animals immunized with plasmids encoding the helicase (pcTPANS3H and pcNS3H) the survival rate was approximately 75%, while the plasmids encoding the protease region (pcTPANS3P and pcNS3P) were not able to confer protection to animals. We further evaluated the effect of the immunization with these plasmids in the liver tissue, in animals not infected with DENV, and we detect focal areas with hemorrhage and edema, which were more extensive in mice inoculated with plasmids encoding the full-length protein or helicase domain. Damages were also observed in the hepatic parenchyma of animals immunized with plasmids encoding the NS3 protease, with a concomitant increase of the hepatic enzyme alanine aminotransferase (ALT) serum levels. Despite the observed regions with edema and hemorrhage, no changes in vascular permeability were detected in the liver or other organs examined in animals inoculated with plasmids encoding the full-length NS3 protein. On the other hand, animals infected with DENV2 by the intra-cerebral (i.c.) route, showed vascular permeability changes in spleen, liver, stomach and kidneys, during the onset of the clinical signs of infection. The occurrence of liver injuries in animals expressing the NS3 was followed by an increase of CD8+ T cells in this organ, and the increase of activated CD4+ and CD8+ T cells in the blood, detected by flow cytometry. In addition, we observed a cellular immune response, with production of gamma interferon (IFN-γ) in splenocytes from these animals, after stimulation with v a peptide present in the NS3 and described as immunogenic to Balb/c mice. Therefore, results suggest the involvement of a cellular immune response in the mechanism of protection induced by the DNA vaccines based on the NS3 in animals challenged with DENV by the i.c. route. However, such response may also be involved in the induction of the hepatic damages observed in immunized animals.
Keywords: Dengue
Proteína NS3
Patogênese Homeopática
Issue Date: 2011
Publisher: Instituto Oswaldo Cruz
Citation: SANTOS, Anna Paula Yorio dos. Avaliação do papel da proteína NS3 do vírus da dengue na proteção ou patogênese em camundongos. Rio de Janeiro, 2011. 117 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2011.
Date of defense: 2011-08-23
Place of defense: Instituto Oswaldo Cruz
Department: Vice Direção de Ensino, Informação e Comunicação
Defense institution: Instituto Oswaldo Cruz
Program: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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