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AVALIAÇÃO DO PAPEL DA PROTEÍNA NS3 DO VÍRUS DA DENGUE NA PROTEÇÃO OU PATOGÊNESE EM CAMUNDONGOS
Santos, Anna Paula Yorio dos | Data do documento:
2011
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
A dengue é considerada uma das mais importantes arboviroses humanas,
sendo causa de morbidade e mortalidade na maioria das regiões tropicais e
subtropicais do mundo. Os sintomas da doença variam desde a febre do dengue até
a febre hemorrágica e síndrome do choque. O desenvolvimento de uma vacina
contra dengue, que confira imunidade protetora de longa duração contra os quatro
sorotipos, é uma das prioridades da Organização Mundial da Saúde (OMS). Porém,
tais estudos esbarram em algumas dificuldades, entre elas a pouca compreensão da
patogênese da doença principalmente no que diz respeito aos casos mais graves.
Algumas evidências apontam a proteína não estrutural 3 (NS3) de dengue como
antígeno protetor, por um lado, enquanto outras sugerem que esta proteína está
relacionada à patogênese da doença. Sendo assim, este trabalho visa avaliar o
efeito da expressão da proteína NS3 em camundongos utilizando vacinas de DNA,
no que concerne à proteção e/ou patogênese da dengue, e estudar as respostas
imunes envolvidas nestes processos. Inicialmente, a capacidade protetora da NS3
inteira ou somente seus domínios funcionais (protease e helicase) foi avaliada em
animais vacinados e desafiados com vírus da dengue sorotipo 2 (DENV2).
Observamos que 90% e 80% dos animais imunizados com os plasmídeos baseados
na NS3 inteira, pcTPANS3 e pcNS3, respectivamente, sobreviveram ao desafio.
Entretanto, 40% e 60% destes camundongos apresentaram sinais clínicos da
doença. Nos animais imunizados com os plasmídeos que codificam a helicase
(pcTPANS3H e pcNS3H), a taxa de sobrevivência foi de aproximadamente 75%,
enquanto que os plasmídeos que codificam a região da protease (pcTPANS3P ou
pcNS3P) não foram capazes de conferir proteção aos animais. Posteriormente,
avaliamos o efeito das imunizações com alguns destes plasmídeos no tecido
hepático dos animais não infectados com DENV, e detectamos áreas focais com
hemorragia e edema, que foram maiores em animais inoculados com plasmídeos
que codificam a proteína NS3 inteira ou a porção helicase. Foram observados,
também, danos no parênquima e aumento dos níveis séricos da enzima hepática
alanina aminotransferase (ALT) em animais imunizados com o plasmídeo que
codifica a porção protease da NS3. Apesar dos focos de edema e hemorragia, não
foram detectadas alterações de permeabilidade vascular no fígado ou em outros
órgãos analisados de animais inoculados com os plasmídeos que codificam a
proteína NS3 inteira. Os animais infectados com DENV2 por via intra-cerebral (i.c.)
apresentaram alterações vasculares no baço, fígado, estômago e rins no período do
aparecimento dos sinais clínicos da infecção. A ocorrência de danos no fígado de
animais que expressam a proteína inteira foi acompanhada de aumento de células T
iii
CD8+ neste órgão, além do aumento de células T CD4+ e T CD8+ ativadas no
sangue, detectadas por citometria de fluxo. Além disso, foi observada uma resposta
imune celular com produção de interferon gamma (IFN-γ) em esplenócitos
provenientes destes animais, após estímulo com um peptídeo presente na NS3 e
descrito como imunogênico para camundongos Balb/c. Portanto, os resultados
sugerem a participação de uma resposta imune celular no mecanismo de proteção
induzido pelas vacinas de DNA baseadas na NS3 nos testes de desafio com DENV
por via i.c.. Contudo, esta resposta pode estar envolvida também na indução dos
danos hepáticos observados nos animais imunizados.
Resumo em Inglês
Dengue is considered one of the most important human arboviruses diseases,
causing morbidity and mortality in most tropical and subtropical regions of the world.
The disease symptoms range from dengue fever to dengue hemorrhagic fever and
shock syndrome. The development of a dengue vaccine that confers long-term
protective immunity against all four serotypes is one of the priorities of world health
organization (WHO). However, such studies face some difficulties, such as the poor
understanding of the disease pathogenesis, especially in severe cases. Some
evidences point that the dengue nonstructural protein 3 (NS3) is a protective antigen,
while other suggest that this protein is involved in the pathogenesis of the disease.
Therefore, this work aims to evaluate the effect of the NS3 protein expression in mice
using DNA vaccines, regarding protection and/or the pathogenesis of dengue and
also to study the immune responses involved in these processes. Initially, the
protective role of the full-length NS3 or its functional domains (protease and helicase)
was evaluated in vaccinated mice challenged with dengue 2 virus (DENV2). We
observed that 90% and 80% of the animals immunized with plasmids based on the
full-length NS3, pcTPANS3 and pcNS3, respectively, survived the challenge.
However 40% and 60% of these mice showed clinical signs of the disease. In
animals immunized with plasmids encoding the helicase (pcTPANS3H and pcNS3H)
the survival rate was approximately 75%, while the plasmids encoding the protease
region (pcTPANS3P and pcNS3P) were not able to confer protection to animals. We
further evaluated the effect of the immunization with these plasmids in the liver
tissue, in animals not infected with DENV, and we detect focal areas with
hemorrhage and edema, which were more extensive in mice inoculated with
plasmids encoding the full-length protein or helicase domain. Damages were also
observed in the hepatic parenchyma of animals immunized with plasmids encoding
the NS3 protease, with a concomitant increase of the hepatic enzyme alanine
aminotransferase (ALT) serum levels. Despite the observed regions with edema and
hemorrhage, no changes in vascular permeability were detected in the liver or other
organs examined in animals inoculated with plasmids encoding the full-length NS3
protein. On the other hand, animals infected with DENV2 by the intra-cerebral (i.c.)
route, showed vascular permeability changes in spleen, liver, stomach and kidneys,
during the onset of the clinical signs of infection. The occurrence of liver injuries in
animals expressing the NS3 was followed by an increase of CD8+ T cells in this
organ, and the increase of activated CD4+ and CD8+ T cells in the blood, detected by
flow cytometry. In addition, we observed a cellular immune response, with production
of gamma interferon (IFN-γ) in splenocytes from these animals, after stimulation with
v
a peptide present in the NS3 and described as immunogenic to Balb/c mice.
Therefore, results suggest the involvement of a cellular immune response in the
mechanism of protection induced by the DNA vaccines based on the NS3 in animals
challenged with DENV by the i.c. route. However, such response may also be
involved in the induction of the hepatic damages observed in immunized animals.
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