Caracterização molecular e bioquímica de carboidrases digestivas em larvas de Lutzomyia longipalpis

Abstract

Lutzomyia longipalpis é o principal vetor da leishmaniose visceral no Novo Mundo. Em flebotomíneos as fases adultas e imaturas exploram diferentes fontes alimentares. Os adultos se alimentam de seiva vegetal (no caso de machos e fêmeas) ou sangue (no caso das fêmeas) e as larvas crescem em material orgânico em decomposição, principalmente de origem vegetal ou fezes de animais. Com relação à digestão das larvas, poucos trabalhos vêm sendo desenvolvidos, entretanto, atualmente é sugerido na literatura que as larvas se alimentam de microorganismos contidos em sua dieta. No presente trabalho foram caracterizadas sob o ponto de vista bioquímico as carboidrases digestivas presentes em larvas de L. longipalpis. Ensaios bioquímicos mostraram atividade enzimática no homogenato do tubo digestivo de -1,3-glucanase, quitinase, lisozima, amilase,  e - glicosidase,  e -manosidase, N-acetilglicosaminidase e sialidase. Beta-1,3-glucanase e amilase foram as hidrolases com as maiores atividades, estando localizadas majoritariamente no espaço endoperitrófico. As enzimas lisozima/quitinase, - e -glicosidases, N-acetil-glicosaminidase mostraram maiores atividades enzimáticas no epitélio intestinal do tubo digestivo de larvas de L. longipalpis, enquanto sialidase e - manosidade apresentaram atividades equiparadas entre conteúdo luminal e epitélio intestinal no tubo digestivo das fases larvais. Cromatografia de filtração em gel e propriedades cinéticas mostraram que as isoformas solúveis de todas as enzimas encontradas nos tubos digestivos das formas larvais de L. longipalpis são diferentes das isoformas encontradas na dieta. O pirosequenciamento utilizando 454 Genome Sequencer FLX (Roche Applied Science) originou cerca de 223.093 reads e a montagem desses gerou 2883 transcritos, os quais 97% foram anotados. A anotação dos transcritos encontrados no transcriptoma mostou a preseça de enzimas cruciais para a digestão de proteínas, carboidratos e lipídios, bem como enzimas importantes para a detoxificação de xenobióticos, estresse oxidativo, resposta imune além da presença de peritrofinas, mucinas e hemocianinas. A análise pelo GO classificou 2195 isotigs em três categorias: função molecular, processos biológicos e componentes celulares, onde a maioria dos transcritos foi caracterizado como atividade catalítica (função molecular), processos metabólicos (processo biológico) e célula (componentes celulares). Tendo em vista a ingestão de microorganismos na dieta alimentar de larvas de flebotomíneo, o presente trabalho pesquisou na biblioteca de EST de L. longipalpis membros das enzimas glicosídeo hidrolases pertencentes às famílias 16 (- 1,3-glucanases), 18 (quitinases) e 22 (lisozimas), onde foi encontrado um total de 3, 5 e 1 sequências, respectivamente. Os transcritos NSFM-24g06 e NSFM-140g04 foram expressos no tubo digestivo das larvas quando comparados à expressão na carcaça. Outros transcritos foram mais expressos na carcaça e/ou cabeça ou não foram expressos em nenhum tecido das formas larvais. Diante dos dados obtidos nesse trabalho é sugerido que o perfil de carboidrases encontradas no tubo digestivo de larvas de L. longipalpis é coerente com o hábitat de vida detritívoro e provavelmente participa da digestão de bactérias e fungos. Além disso, propomos que os transcritos NSFM-24g06 and NSFM-140g04 correspondem a atividade de -1,3-glucanase e quitinase digestivas os quais podem representar importantes alvos para supressão ou inibição da digestão desse vetor.