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Title: Regulação da expressão do gene TcSof1 em Trypanosoma cruzi
Advisor: Dallagiovanna, Bruno
Members of the board: Krieger, Marco Aurelio
Schenkman, Sergio
Nardelli, Sheila
Authors: Poubel, Saloê Bispo
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. O controle da expressão de genes é fundamental para gerar as mudanças morfológicas durante o ciclo de vida do parasita. Entretanto, os tripanosomatídeos possuem peculiaridades quanto a sua biologia molecular, como por exemplo, a transcrição policistrônica e a ausência de promotores definidos para a RNA polimerase II. Acredita-se, portanto, que grande parte da regulação da expressão gênica nestes parasitas ocorra em nível pós-transcricional por mecanismos que envolvem mudanças na estabilidade e no acesso dos mRNAs aos polissomos. Estudos prévios do nosso grupo mostraram que alguns mRNAs que codificam proteínas do complexo proceossomo (SSU) em T. cruzi são mais abundantes em tripomastigotas metacíclicos que em epimastigotas. No entanto, apesar da grande quantidade de mRNAs da proteína TcSof1 nas formas infectantes, o mRNA de TcSof1, esta imobilizado dentro dos polissomos e não é traduzido. O sequestro de mRNA dentro polissomos é uma maneira de bloquear a tradução, sugerindo um mecanismo de regulação negativa da tradução, provavelmente nas etapas de elongação e terminação. O objetivo do nosso trabalho foi caracterizar os mecanismos de regulação da expressão gênica envolvidos na expressão negativa do gene de TcSof1 na forma tripomastigota metacíclica de T. cruzi. Primeiramente isolamos e analisamos mais de 500 RNAs pequenos na forma metaciclica que pudessem estar regulando negativamente a tradução de TcSof1. Embora, nenhum RNA regulador tenha sido identificado, uma grande população de fragmentos de tRNAs foi encontrada. Sua participação na maquinaria de tradução ativa foi excluída, uma vez que os mesmos não foram detectados associados aos polissomos ou ribossomos. Padronizamos e empregamos a técnica de Ribossome Footprinting para a análise da eficiência de tradução em T. cruzi, avaliando a população de mRNA total e os mRNA que estavam associados aos ribossomos, provenientes da forma metacíclica. Os resultados mostraram que de aproximadamente 9.000 genes presentes nesta etapa do ciclo de vida, apenas 4.241 estavam associados aos ribossomos nas amostras do footprinting, ao contrário do que foi visto na forma epimastigota, onde dos 9.000 genes presentes 7. 419 genes estavam associados aos polissomos. Este resultado indica que quase a metade dos genes transcritos nas formas tripomastigotas estão sendo regulados negativamente, provavelmente em nível de tradução. Confirmamos com esta técnica a presença do mRNA de TcSof1 associado aos polissomos na forma metacíclica mesmo sem haver expressão da proteína nesta forma, e outros genes que apresentam o mesmo padrão de expressão também foram analisados. Através do tratamento dos parasitas com a droga harringtonina, um inibidor da tradução, seguido das análises por Ribosome Footprinting, foi possível evidenciar um acúmulo de ribossomos nos locais de inicio da tradução da maioria dos mRNAs mostrando que a droga bloqueia os ribossomos no sitio de inicio da tradução. Pelo contrario, o mRNA de TcSof1 apresentou marcas de ribossomo ao longo de toda a região codificante do gene nas formas metacíclicas, sugerindo que os ribossomos estão parados na etapa de elongação da tradução. Este resultado confirmou que a ausência de expressão desta proteína nesta etapa do ciclo de vida do parasita, é controlada em nível de tradução por um mecanismo de parada dos ribossomos nos polissomos.
Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. The parasite alternates between different morphological and functional forms during its life cycle. Control of gene expression is key to generate the morphological changes during the life cycle of the parasite. However, trypanosomatids display very peculiar cellular processes, as polycistronic transcription and the lack of canonical RNA II polymerase promoters. Therefore, gene expression regulation occurs mainly at the posttranscriptional level by mechanisms that involve changes in the stability of mRNAs and their access to polysomes. Previous studies from our group have shown that some mRNAs, which encode proteins of the proceossome complex (SSU) in T. cruzi, are more abundant in metacyclic trypomastigote than in epimastigote stages. However, even though a greater amount of TcSof1 mRNA is observed in the infective forms and is associated with the polysomes it is not translated. Trapping the mRNA in polysomes is a way to block translation, suggesting a mechanism of translation down-regulation, probably during the elongation and termination stages. The aim of our study was to characterize the mechanisms of gene expression regulation involved in the negative expression of TcSof1 gene in the metacyclic stage of T. cruzi. First, we isolated and analyzed more than 500 small RNAs in the metacyclic form that could be negatively regulating the translation of TcSof1 gene. Although no regulatory RNA was identified, a large population of tRNAs fragments was found. Their association to the active translation machinery was excluded, since they were not detected in association with polysomes or ribosomes. After that, we standardized and applied the Ribosome Footprinting technique to analyze translation efficiency in T. cruzi, and to assess which mRNAs were protected by ribosomes in the metacyclic form. Our results showed that from some 9,000 genes present in this life cycle stage, only 4,241 were associated with ribosomes. On the other hand, in epimastigote forms from 9,000 genes present, 7,419 genes were associated with polysomes. This indicates that almost half of the transcribed genes in metacyclic trypomastigotes are being negatively regulated, probably at translation level. Through the ribosome profiling technique we confirmed ours previous results and showed that TcSof1 mRNA is associated to metacyclic polisomes though the protein is not expressed in this form. Similarly, other genes that have the same TcSof1 expression pattern were also analyzed. By treating parasites with harringtonine, an inhibitor of translation, followed by Ribosome Footprinting analysis, it was possible to show an accumulation of ribosomes at the initiation translation sites of most mRNAs. We could observe the presence of ribosome footprints along the coding region of TcSof1 gene in metacyclic forms, suggesting that ribosomes are stalled onto the mRNA. This result confirms that the absence of protein expression at this stage is controlled at the translation level by a mechanism that stalls the ribosomes on the mRNA.
Keywords: Trypanosoma cruzi
Chagas Disease
TcSof1 Gene
Gene expression
keywords: Trypanosoma cruzi
Doença de Chagas
Gene TcSof1
Expressão Gênica
Issue Date: 2014
Publisher: Instituto Carlos Chagas
Citation: POUBEL, S. B. Regulação da expressão do gene TcSof1 em Trypanosoma cruzi. 2014. 114 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Curitiba, 2014.
Date of defense: 2014-03-20
Place of defense: Curitiba/PR
Department: Instituto Carlos Chagas
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Teses de Doutorado

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