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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27902
ADAPTAÇÃO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) QUANTITATIVA EM TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA LEUCOENCEFALOPATIA MULTIFOCAL PROGRESSIVA (LMP)
Muylaert, Flávia Fontenelle | Date Issued:
2009
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A leucoencefalopatia multifocal progressiva (LMP), doença subaguda desmielinizante do sistema nervoso central (SNC), é causada pelo Poliomavirus Humano JC (JCPyV). Devido ao uso de terapias imunossupressoras e à SIDA a frequência de casos de LMP aumentou consideravelmente nas últimas décadas. O padrão ouro para o diagnóstico da LMP é a biópsia cerebral. Entretanto, apesar do elevado poder diagnóstico, este é um método invasivo, com uma taxa custo/benefício elevada. Assim, utiliza-se a tomografia computadorizada ou a ressonância magnética do crânio para o diagnóstico presuntivo de LMP. Métodos moleculares, em especial a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm se mostrado eficiente no diagnóstico de várias doenças virais do SNC. A nested-PCR (nPCR) é uma técnica mais eficaz na detecção do DNA do JCPyV no liquidocefalorraqueano (LCR), proporcionando maior sensibilidade e especificidade quando comparada à PCR convencional Entretanto, aproximadamente 15% dos casos prováveis de LMP podem não se confirmar pela nPCR. Na era da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), o percentual de casos não confirmados aumentou, chegando à aproximadamente 42%. Publicações recentes nas quais se utilizou a PCR quantitativa (qPCR) em tempo real demonstram que esta técnica pode ser 10 vezes mais sensível quando comparada à PCR convencional na detecção e quantificação do JCPyV, podendo também ser utilizado como um marcador virológico em pacientes em uso de HAART com diagnóstico de LMP. Neste trabalho, elaboramos uma técnica que permite quantificar a carga viral do JCPyV no LCR de pacientes com LMP em razão de acompanhar a resposta do paciente ao tratamento com a HAART. O princípio da técnica qnPCR em tempo real estabelecida foi semelhante ao da nPCR, sendo constituído por dois passos de amplificação sequenciados. O primeiro passo trata-se de uma PCR convencional seguido de nova amplificação, agora utilizando a técnica de qPCR em tempo real e tendo como molde o produto da primeira amplificação Foram analisadas amostras de LCR armazenadas pelo Laboratório de Pesquisa Clínica em Neuroinfecções. Destas, 16 eram de pacientes com confirmação diagnóstica pelo método de nPCR e 10 eram de casos compatíveis mas sem diagnóstico. Pela qnPCR em tempo real, nenhum dos casos compatíveis com LMP apresentou quantificação de carga viral e das 16 amostras positivas, apenas 12 apresentaram sinais de carga que ultrapassaram a linha de base apontando a presença do DNA do JCPyV. Em nossa casuística a nPCR teve sensibilidade de 69,6% enquanto a sensibilidade da qnPCR foi de 52,2%. Concluímos que a questão diagnóstica da LMP ainda persiste, pois não conseguimos aumentar a sensibilidade de detecção do JCPyV no LCR, entretanto, desenvolvemos um método quantitativo que poderá auxiliar como dado da resposta do paciente ao tratamento com a HAART
Abstract
Progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), subacute demyelinating disease of the central nervous system (CNS), is caused by the Human Polyomavirus JC (JCPyV). Due to the use of immunosuppressive therapies and AIDS, the frequency of cases of PML has increased considerably in recent decades. The gold standard for the diagnosis of PML is a brain biopsy. However, despite the high diagnostic power, this is an invasive method, with an average cost/ benefit ratio. Thus, we use computed tomography or magnetic resonance imaging of the skull to the presumptive diagnosis of PML. Molecular methods, particularly polymerase chain reaction (PCR), have proven effective in the diagnosis of various diseases of the CNS. The nested PCR is a technique more effective in the detection of JCPyV DNA in cerebrospinal fluid, providing greater sensitivity and specificity when compared to conventional PCR. However, approximately 15% of probable cases of PML may not be confirmed by nPCR. In the era of highly active antiretroviral therapy (HAART), the percentage of unconfirmed cases increased, reaching to about 42%. Recent publications in which we used the quantitative realtime PCR (qPCR) show that this technique can be 10 times more sensitive compared to conventional PCR in the detection and quantification of JCV, which can also be used as a virological marker in patients using HAART with a diagnosis of PML. In this work, we elaborated a technique to quantify the viral load of JCPyV in CSF of patients with PML due to monitor patient response to treatment with HAART The principle of the technique of realtime qnPCR was similar to that of nested PCR, which consists of two amplification steps sequenced. The first step it is a conventional PCR amplification followed by a new, now using the technique of real-time qPCR and taking as template the product of the first amplification. We analyzed CSF samples stored at the Laboratory of Clinical Research in Neuroinfections. Of these, 16 were from patients with diagnosis confirmed by nPCR method and 10 cases were compatible but no diagnosis. For realtime qnPCR, none of the cases compatible with PML showed viral load and in 16 positive samples, only 12 showed signs of load that exceeded the baseline indicating the presence of JCPyV DNA. In our series the nPCR had a sensitivity of 69,6% while the sensitivity of qnPCR was 52,2%. We conclude that the diagnosis of PML issue still persists, because we can\2019t increase the sensitivity of detection of JCPyV in the CSF, however, developed a quantitative method that could support as a given patient's response to treatment with HAART
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