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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/30220
ENSAIOS MOLECULARES QUANTITATIVOS E BASEADOS EM TEMPERATURA DE DISSOCIAÇÃO DO DNA PARA DIAGNÓSTICO ESPECÍFICO DA INFECÇÃO POR LEISHMANIA SPP
Reação em Cadeia da Polimerase
Manejo de Espécimes
Carga Parasitária
Filgueira, Camila Patricio Braga | Date Issued:
2018
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A leishmaniose é uma doença negligenciada, presente na Europa, Ásia, África e nas Américas, abrangendo infecções assintomáticas e duas formas clínicas principais: Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Tegumentar (LT). É causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos pela fêmea de flebotomíneos vetores. Sabe-se que as diferentes espécies de Leishmania estão associadas às diferentes formas clínicas da doença e ao seu prognóstico. O diagnóstico da leishmaniose é feito a partir da combinação de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, mas principalmente através do isolamento e cultivo dos parasitos, que pode ser seguido de ensaio de isoenzimas para identificação da espécie. Este processo, contudo, tem baixa eficiência, além de demandar tempo e recursos que podem ser minimizados com a utilização de abordagem molecular diretamente em material clínico. A técnica de PCR em tempo real (qPCR) tem sido amplamente utilizada para detecção da infecção por Leishmania e para a quantificação da sua carga parasitária, por se tratar de uma metodologia simples, rápida e extremante sensível, capaz de detectar concentrações muito baixas de parasitos presentes em uma amostra A análise de curvas de dissociação por High Resolution Melting (HRM) tem como principal vantagem permitir investigar toda a região amplificada pelos iniciadores e tem sido utilizada para a identificação de espécies por apresentar uma sensibilidade capaz de identificar diferenças de até um nucleotídeo entre sequências de DNA. A realização de um estudo que estabeleça uma metodologia capaz de detectar e identificar espécies de Leishmania, e que inclua uma validação analítica para uma padronização adequada e permita a determinação da carga parasitária em paralelo, para possibilitar a associação desses dados, ainda se faz necessária. Assim, o objetivo deste trabalho é estabelecer uma metodologia baseada em qPCR e HRM, que dispense o isolamento e cultivo do parasito, e que permita a detecção, identificação de espécies de Leishmania e a quantificação da carga parasitária diretamente em material clínico. Para isso, as metodologias de qPCR e HRM foram padronizadas com cepas de referência e posteriormente validadas com amostras clínicas de pacientes de Rondônia, Brasil, diagnosticados com leishmaniose cutânea, sendo realizada a quantificação da carga parasitária por qPCR e a identificação da espécie envolvida por HRM. Os resultados apontam que o alvo HSP70 é melhor indicado para determinar a carga parasitária de Leishmania. Além disso, estabelecemos um algoritmo para a identificação das principais espécies de Leishmania de relevância clínica por HRM, a partir da combinação de dois alvos moleculares, HSP70 e COI.
Abstract
Leishmaniasis is a neglected disease present in Europe, Asia, Africa and Americas encompassing asymptomatic infections and two main clinical forms: Visceral Leishmaniasis (VL) and Cutaneous Leishmaniasis (CL). It is caused by protozoan parasites from Leishmania genus, transmitted by sand fly vectors. It is known that different Leishmania species are associated with different clinical forms of the disease and its prognosis. Diagnosis of leishmaniasis usually combine clinical, epidemiological and laboratory data, involving isolation and parasite cultivation followed by isoenzymatic assay for species identification. However, this process has low efficiency and requires time and resources that can be minimized by applying molecular approach directly in clinical samples. Real Time PCR technique (qPCR) has been widely used to detect Leishmania infection and to quantify parasite load, once it is a simple, rapid and extremely sensitive methodology, capable to detect very low parasite concentrations High Resolution Melting curve analysis allows the entire investigation of amplified region and has been used for species identification since it presents a sensitivity capable of identify differences of a single nucleotide in DNA sequences. Current methods are unable to simultaneously detect and identify Leishmania or quantify the parasite load. An improvement on these methods that includes analytical validation, standartization and data association is still needed. Thus, the purpose of this study is to stablish a methodology based on qPCR and HRM that allows detection, species identification and parasite load, directly from clinical samples, without the need of parasite isolation and cultivation. Thereby, qPCR and HRM methodologies were standardized using reference strains e subsequently validated with clinical samples from patients with cutaneous leishmaniasis from Rondônia, Brasil. Parasite load by qPCR and species identification by HRM were performed. The results obtained show that HSP70 is the best target to determine parasite load of Leishmania by qPCR. Furthermore, an algorithm was developed for identification of main Leishmania species with clinical relevance by HRM, using two molecular targets, HSP70 and COI.
Keywords in Portuguese
LeishmaniaReação em Cadeia da Polimerase
Manejo de Espécimes
Carga Parasitária
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