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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34581
ESTUDO FUNCIONAL DE PROTEÍNAS DA FAMÍLIA DAS GELSOLINAS DE SCHISTOSOMA MANSONI
Araújo, Juliano Michel de | Date Issued:
2018
Author
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract in Portuguese
Técnicas de genética reversa como RNA de interferência a (RNAi) são um conjunto de ferramentas poderosas utilizadas em caracterizações funcionais. Essas técnicas têm sido aplicadas na identificação e validação de proteínas de Schistosoma mansoni, possibilitando uma melhor compreensão da interação hospedeiro-parasito e a identificação de alvos vacinais e de drogas. Proteínas imunorreativas a soro de indivíduos infectados e não infectados, ou naturalmente resistentes, de área endêmica para esquistossomose foram identificadas, dentre elas, proteínas da família das gelsolinas. Em alguns organismos as gelsolinas desempenham funções na regulação dos filamentos de actina que participam na formação do citoesqueleto, motilidade celular e estimulação da apoptose. Devido a importância das gelsolinas, elas foram escolhidas para caracterização por RNAi. Os níveis de transcritos e proteínas foram analisados nas diferentes fases do ciclo de vida doS. mansoni e também em esquistossômulos silenciados, nesses, também foi feita a análise de
fenótipo. O papel das gelsolinas na interação parasito-hospedeiro foi estudado através da infecção de camundongos com parasitos silenciados. Sua localização foi determinada e níveis proteicos também foram acessados por imunofluorescência. Os resultados mostraram que os
genes são mais expressos em vermes adultos fêmeas e, a proteína, é expressa em todas as fases do ciclo de vida do verme sendo mais abundante nas fases de cercária e esquistossômulo. Foi constatada uma distribuição difusa das gelsolinas por todo o esquistossômulo e co-localização com filamentos de actina, principalmente no tegumento. Assim, é possível que gelsolinas de S. mansoni estejam envolvidas em mecanismos de organização do citoesqueleto. Seis dias depois do tratamento com dsRNA foram verificados os níveis de silenciamento dos transcritos para esquistossômulos expostos à dsRNA-gelsolina (77%), vilina (93%) e para ambos, gel/vil (71%-gel e 89%- vil). A análise por densitometria óptica das bandas mostrou que esquistossômulos expostos ao dsRNA-gelsolina, -gelsolina/vilina e -vilina não apresentaram
diminuição nos níveis proteicos em relação aos parasitos tratados com dsRNA-GFP, apesar de que em ensaio de imunofluorescência, esquistossômulos silenciados para os mesmos genes apresentaram uma diminuição na intensidade de fluorescência, respectivamente de: 9,9%,
11,9% e 39,1%. O fenótipo e viabilidade permaneceram inalterados para todos os tratamentos. Camundongos infectados com esquistossômulos silenciados foram perfundidos e não houve relação entre número de vermes e número de ovos retidos no figado e intestino. Este trabalho traz importantes conhecimentos acerca da expressão de gelsolina e vilina nas diferentes faseso ciclo de vida de S. mansoni, suas localizações e entendimento sobre a importância destas proteínas no desenvolvimento do parasito. É necessário ressaltar a importância de estudos de caracterização funcional de genes na era pós-genômica, uma vez que, até hoje; há poucas
proteínas caracterizadas em S. mansoni.
Abstract
Reverse genetics techniques, such as RNA interference (RNAi), are a powerful set of tools for functional characterization. The application of those techniques in the identification and validation of proteins of the Schistosoma mansoni, enables a better comprehension of the host-parasite interaction and the identification of vaccines and drugs. Serum immunoreactive proteins from infected and uninfected or naturally resistant, individuals from endemic area for schistosomiasis were identified, among those, proteins from the gelsolin family. In some organisms, gelsolins play roles in the regulation of actin filaments that participate in the cytoskeleton formation, cellular motility and apoptosis stimulation. Due to gelsolin importance, they are chosen for characterization using RNA interference. The levels of transcripts and proteins were analyzed in the different phases of the life cycle of the S. mansoni and also in knockdown schistosomule, in these; a phenotypic analysis was also carried out. The role of gelsolins in the host-parasite interaction was studied by the infection of mice with knockdown parasites. Its location was determined and proteins levels were also assessed by immunofluorescence. The results evidenced that both genes are more expressed in female adult worms and, the proteins, are present in all phases of the parasite life cycle, being more abundant in cercariae and schistosomule. The localization of gelsolins was determined by immunofluorescence and was verified the diffuse distribution throughout the schistosomule and co-localization with actin filaments, especially in the
tegument. Thus, it is possible that the S. mansoni gelsolins are involved in mechanisms of cytoskeleton organization. Six days after dsRNA exposure, transcriptional levels of knockdown parasites were verified for schistosomules exposed to dsRNA-gelsolin (77%), vilin (93%) and, for both, gel/vil (71% -gel and 89% -vil). The analysis of the optical densitometry of the bands showed that schistosomules exposed to dsRNA-gelsolin, -gelsolin/vilin and -vilin presented no decrease in protein levels in comparison to parasites treated with dsRNA-GFP, although in immunofluorescence assays, schistosomules knockdown for those
genes showed a decrease in fluorescence intensity, respectively: 9.9% (gelsolin), 11.9% (vilin) and 39.1% (both), respectively. The phenotype and viability remained unchanged for all treatments. Mice infected with knockdown schistosomule were perfused and there was no correlation between number of worms and number of eggs retained in the liver and intestine. This work presents important knowledge regarding the expression of gelsolin and vilin in the different life stages of the S. mansoni, their localization and understanding of the importance of these proteins in the parasite development. It is necessary to emphasize the importance of gene functional characterization studies in the post-genomic era, since, up o now; there are few characterized proteins in the S. mansoni.
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