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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/61494
DESENVOLVIMENTO DE UMA PROVA DE CONCEITO PARA AVALIAR A AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA MEDIADA POR LOOP (LAMP-K26) NO DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
Garcia, Thábata Santos | Date Issued:
2023
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brazil.
Abstract in Portuguese
A leishmaniose visceral (LV) zoonótica é causada por protozoários da espécie Leishmania infantum e os cães são os principais reservatórios em áreas urbanas. O correto diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) é fundamental no controle da LV, evitando a permanência de animais infectados como fonte de infecção para vetores. Técnicas sorológicas para diagnóstico da LVC apresentam limitações quanto à sensibilidade e especificidade, enquanto técnicas moleculares apresentam maior complexidade de realização e custo mais elevado. Nesse contexto, a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) surge como uma ferramenta diagnóstica de maior aplicabilidade, sem necessidade de equipamentos complexos, com custo reduzido e rapidez na entrega de resultados. Este estudo propôs o desenvolvimento de uma prova de conceito para avaliar a LAMP-K26 no diagnóstico da LVC e foi composto por duas etapas complementares, realizadas em um abrigo de cães no município de Vespasiano, Minas Gerais. A primeira etapa determinou a soroprevalência de anticorpos anti-Leishmania pelos testes TR DPP® e ELISA IDEXX, a taxa de positividade pelo PCR/kDNA e PCR-RFLP/hsp70 e ITS-1 em fragmentos de pele e a soroconversão de cães após três meses pelo teste ELISA IDEXX. Na segunda etapa, foi montado um painel dividido em dois grupos: (i) não caso, com 15 amostras com resultados sorológicos não reagentes e moleculares negativos da primeira etapa, e (ii) caso, com 28 amostras com resultados sorológicos reagentes e moleculares positivos, recuperadas do banco do Grupo de Estudos em Leishmanioses (GEL) do Instituto René Rachou. A soroprevalência foi de 39,7% no TR DPP® e 8,6% no ELISA IDEXX, a concordância entre os testes foi de 62,1% e a soroconversão pelo teste ELISA IDEXX foi de 55%. A taxa de positividade dos testes moleculares foi de 46,9% (PCR/kDNA), 3,1% (PCR-RFLP/hsp70) e 37,5% (PCR-RFLP/ITS-1). A LAMP-K26 foi capaz de detectar até 100fg de DNA de L. infantum, após 30 minutos de reação, e não amplificou DNA de outras espécies de Leishmania, com sensibilidade de 96,4%, especificidade de 93,3% e acurácia de 95,4%. Este é o primeiro estudo de avaliação da LAMP-K26 no diagnóstico da LVC e nossos resultados demonstraram uma excelente performance para detecção molecular de DNA de L. infantum em pele de cães, abrindo perspectivas de novos estudos com maior número amostral, diferentes tipos de amostras e, preferencialmente, prospectivos.
Abstract
Zoonotic visceral leishmaniasis (VL) is is caused by protozoa of the Leishmania infantum species and dogs are the main reservoirs in urban areas. The correct diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) is fundamental in the control of VL, avoiding the permanence of infected animals as a source of infection for vectors. Serological techniques for diagnosing CVL have limitations in terms of sensitivity and specificity, while molecular techniques are more complex and costly. In this context, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) emerges as a diagnostic tool with greater applicability, without the need for complex equipment, with reduced cost and quick delivery of results. This study proposed the development of a proof of concept to evaluate LAMP-K26 in the diagnosis of CVL and consisted of two complementary steps, carried out in a dog shelter in the municipality of Vespasiano, Minas Gerais. The first step determined the seroprevalence of anti-Leishmania antibodies by the TR DPP® and ELISA IDEXX tests; the positivity rate by PCR/kDNA and PCR-RFLP/hsp70 and ITS-1 in skin fragments; and the seroconversion of dogs after three months by the IDEXX ELISA test. In the second stage, a panel was assembled divided into two groups: (i) non-case, with 15 samples with non-reagent serological and negative molecular results from the first stage, and (ii) case, with 28 samples with positive serological and molecular results, retrieved from the database of the Leishmaniasis Study Group (GEL) at the René Rachou Institute. The seroprevalence was 39.7% in the TR DPP® and 8.6% in the ELISA IDEXX, the concordance between the tests was 62.1% and the seroconversion by the ELISA IDEXX test was 55%. The positivity rate of the molecular tests was 46.9% (PCR/kDNA), 3.1% (PCR-RFLP/hsp70) and 37.5% (PCR-RFLP/ITS-1). LAMP-K26 was able to detect up to 100fg of L. infantum DNA, after 30 minutes of reaction, and did not amplify DNA from other Leishmania species, with a sensitivity of 96.4%, specificity of 93.3% and accuracy of 95.4%. This is the first evaluation study of LAMP-K26 in the diagnosis of CVL and our results demonstrated an excellent performance for molecular detection of L. infantum DNA in dog skin, opening perspectives for new studies with a larger sample number, different types of samples and, preferably, prospective.
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