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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/63896
METAGENÔMICA DE COMPONENTES PARTICULADOS DO AR CAPTURADOS POR DRONES AUTÔNOMOS EM UMA METRÓPOLE
Dispositivos aéreos não tripulados
Ar
Microbiologia do ar
Análise de sequência de DNA
Dispositivos aéreos no tripulados
Aire
Microbiología del aire
análisis de secuencia de ADN
Dantas, Pedro Henrique Lopes Ferreira | Date Issued:
2023
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Symbiomics. Florianópolis, SC, Brasil
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Symbiomics. Florianópolis, SC, Brasil
Abstract in Portuguese
A microbiologia estuda a biologia de microrganismos, que engloba organismos dos mais
diferentes ramos da árvore da vida. No século XX, parte do conhecimento a respeito das
bactérias foi adquirido pelo advento das técnicas de cultivo. Com o surgimento do
sequenciamento de nova geração (NGS), metodologias novas foram sendo desenvolvidas a fim
de aprofundar o conhecimento que se tinha a respeito desses organismos. A metagenômica é
uma técnica de sequenciamento de ácidos nucleicos que permite explorar comunidades
microbiológicas em amostras biológicas ou ambientais independentemente de técnicas de
cultivo. O ar é um compartimento da biosfera pouco explorado devido a vários fatores, como a
dificuldade de coleta, que consequentemente leva a deficiência na análise da composição
microbiana do ar. Nós propomos uma nova metodologia que proporciona uma coleta mais
flexível do ar, por meio de um coletor de ar acoplado à um drone, onde a composição será
resolvida por meio da abordagem da metagenômica. Coletores de ar foram desenvolvidos pelo
nosso próprio grupo de pesquisa em parceria com a Plataforma Unificada de Modelagem e
Manufatura Aditiva (PLUMMA-3D FIOCRUZ Minas Gerais). Utilizando os coletores
acoplados à um drone modelo DJI Inspire 2, foram realizados sobrevoos em diferentes altitudes
ao nível do solo e acima do solo. Acoplado aos coletores foram utilizados tubos cônicos
possuindo tampão de amostra PBS. As amostras coletadas foram extraídas utilizando protocolo
de fenol/clorofórmio, o DNA foi submetido à amplificação através da PCR, e o amplicon foi
utilizado na construção das bibliotecas para sequenciamento. As bibliotecas foram
quantificadas e o sequenciamento foi realizado em uma plataforma Illumina MiSeq. A análise
da qualidade dos dados foi conduzida para remoção das bases ambíguas (Ns) e de baixa
qualidade. Posteriormente, foi feita a inferência das variantes de sequenciamento de amplicon
(ASVs). Por fim, análises de diversidade alfa e beta foram conduzidas, além de análises para
abundância diferencial dos táxons. Os coletores desenvolvidos se mostraram capazes de coletar
biomassa a partir do ar e o gel de agarose 1% confirmou a amplificação do nosso fragmento de
interesse (rRNA 16S V3/V4). Além disso, as bibliotecas também foram validadas através de
gel de agarose 1%. Após o sequenciamento e o tratamento de qualidade, um total de ~3 milhões
de leituras foram utilizadas para a etapa inferência de ASVs, com uma média de ~160.000
leituras por amostra. Um total de 1878 ASVs foram preditas ao longo das amostras e tais ASVs
foram classificadas em diferentes níveis taxonômicos. Neste trabalho, foi possível estabelecer
um fluxo de coleta, processamento e análises de dados para amostras de ar, utilizando drones e
a metagenômica para tal. Entretanto, dificuldades nesse tipo de trabalho foram expostas após
análises de diversidade alfa e beta e o desenvolvimento de técnicas de processamento de
material genético para amostras com baixa biomassa e com maior reprodutibilidade são
necessárias. Por fim, espera-se então que este estudo possa contribuir com o conhecimento
acerca do microbioma presente no ar e que sirva de estímulo para novos trabalhos desta
natureza.
Abstract
Microbiology studies the biology of microorganisms, which encompasses organisms from the
most different branches of the tree of life. In the twentieth century, part of the knowledge about
bacteria was acquired by the advent of cultivation techniques. With the emergence of next
generation sequencing (NGS), new methodologies were being developed in order to deepen the
knowledge that was had about these organisms. Metagenomics is a nucleic acid sequencing
technique that allows exploring microbiological communities in biological or environmental
samples independently of cultivation techniques. The air is a compartment of the biosphere
little explored due to several factors, such as the difficulty of collection, which consequently
leads to a deficiency in the analysis of the microbial composition of the air. We propose a new
methodology that provides a more flexible collection of air, through an air collector coupled to
a drone, where the composition will be resolved through the metagenomics approach. Air
collectors were developed by our own research group in partnership with the Unified Modeling
and Additive Manufacturing Platform (PLUMMA-3D FIOCRUZ Minas Gerais). Using the
collectors coupled to a DJI Inspire 2 model drone, flyovers were performed at different altitudes
at ground level and above ground. Connected to the collectors, conical tubes containing PBS
sample buffer were used. The collected samples were extracted using a phenol/chloroform
protocol, the DNA was subjected to amplification through PCR, and the amplicon was used in
the construction of libraries for sequencing. Libraries were quantified and sequencing was
performed on an Illumina MiSeq platform. Data quality analysis was conducted to remove
ambiguous bases (Ns) and low quality. Subsequently, the inference of amplicon sequencing
variants (ASVs) was made. Finally, analyzes of alpha and beta diversity were conducted, in
addition to analyzes for differential abundance of taxa. The collectors developed were able to
collect biomass from air and the 1% agarose gel confirmed the amplification of our fragment
of interest (rRNA 16S V3/V4). In addition, the libraries were also validated using a 1% agarose
gel. After sequencing and quality handling, a total of ~3 million reads were used for the ASV
inference step, with an average of ~160,000 reads per sample. A total of 1878 ASVs were
predicted over the samples and such ASVs were classified into different taxonomic levels. In
this work, it was possible to establish a data collection, processing and analysis flow for air
samples, using drones and metagenomics to do so. However, difficulties in this type of work
were exposed after analyzes of alpha and beta diversity and the development of techniques for
processing genetic material for samples with low biomass and with greater reproducibility are
necessary. Finally, it is hoped that this study can contribute to knowledge about the microbiome
present in the air and that it will serve as a stimulus for further work of this nature.
Keywords in Portuguese
MetagenômicaDispositivos aéreos não tripulados
Ar
Microbiologia do ar
Análise de sequência de DNA
Keywords in Spanish
MetagenómicaDispositivos aéreos no tripulados
Aire
Microbiología del aire
análisis de secuencia de ADN
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