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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/63957
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE PCR PARA DIAGNÓSTICO DA ESPOROTRICOSE FELINA E CANINA EM PELES EMBLOCADAS EM PARAFINA
Luiz, Raul Leal Faria | Date Issued:
2021
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A esporotricose é uma micose granulomatosa crônica, cosmopolita, que acomete humanos e animais. A infecção é causada por fungos dimórficos do complexo Sporothrix schenckii. No Brasil, o Rio de Janeiro é considerado área hiperendêmica de esporotricose causada por S. brasiliensis associada à transmissão zoonótica felina. O método padrão de referência para o diagnóstico de esporotricose é a caracterização microscópica do patógeno isolado em cultura, porém essa metodologia é demorada. Caso a cultura micológica não seja possível, as amostras clínicas podem ser previamente fixadas em formalina tamponada a 10% e emblocadas em parafina (FFEP). Métodos moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção das sequências de DNA fúngico, também podem ser utilizados para o diagnóstico por serem rápidos, sensíveis e espécie-específicos e, além disso, podem ser aplicados em amostras frescas e FFEP. Não existe até o momento um protocolo estabelecido para a extração de DNA do fungo Sporothrix spp. em amostras FFEP de esporotricose felina e canina, assim como não existe ainda uma metodologia padronizada e reprodutível para realização da PCR para o diagnóstico definitivo da esporotricose felina e canina a partir de tecidos FFEP. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a sensibilidade de duas técnicas de PCR para o diagnóstico de esporotricose felina e canina, em nível de gênero, em tecidos FFEP. Foram utilizadas seis espécies diferentes de Sporothrix (S. chilensis, S. mexicana, S. pallida, S. globosa, S. brasiliensis e S. schenckii) de pellets obtidos por centrifugação de cultura micológica e FFEP para padronização da metodologia de extração e identificação molecular Foram também utilizadas 14 amostras de peles de gatos e 20 amostras de peles de cães atendidos no Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos (LAPCLINDERMZOO), Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, no período de 2009 a 2019, cujo diagnóstico de esporotricose foi confirmado por cultura micológica para validação das metodologias. Neste estudo, as amostras FFEP foram submetidas a dois protocolos de cortes histológicos: (1) 8 cortes de 5 µm de espessura; e (2) um corte de 16 µm de espessura, e à extração de DNA de Sporothrix spp. utilizando dois kits comercias para tecidos FFEP (extração química e térmica), sendo os mesmos validados no presente estudo. O DNA extraído foi utilizado para identificação molecular pela técnica da nested PCR, em nível de gênero de Sporothrix spp., para o diagnóstico da esporotricose felina e canina em tecidos FFEP baseada na amplificação para a região 18S do RNA ribossomal (ITS). O protocolo de extração química utilizando o protocolo de 8 cortes histológicos de 5 µm de espessura apresentou melhor desempenho. O ensaio da nested PCR, utilizando primers específicos para o gênero Sporothrix, apresentou alta sensibilidade e especificidade para identificar esse fungo em amostras FFEP de pellets de cultura micológicas. As metodologias de extração de DNA e da nested PCR utilizadas apresentam grande potencial para serem aplicadas no diagnóstico da esporotricose felina e canina em amostras FFEP na rotina clínica
Abstract
Sporotrichosis is a cosmopolitan, chronic granulomatous mycosis that affects humans and animals. The infection is caused by dimorphic fungi of the Sporothrix schenckii complex. In Brazil, Rio de Janeiro is considered a hyperendemic area of sporotrichosis caused by S. brasiliensis associated with feline zoonotic transmission. The standard reference method for the diagnosis of sporotrichosis is the microscopic characterization of the pathogen isolated in culture, but this methodology is time-consuming. If mycological culture is not possible, clinical samples can be previously fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin (FFPE). Molecular methods, such as polymerase chain reaction (PCR) for detection of fungal DNA sequences, can also be used for diagnosis because they are fast, sensitive and species-specific and, in addition, can be applied to fresh samples and FFPE samples. There is no established protocol for extracting DNA from the fungus Sporothrix spp. in feline and canine sporotrichosis FFPE samples, as well as there is still no standardized and reproducible methodology for performing PCR for the definitive diagnosis of feline and canine sporotrichosis from FFPE tissues. The present work aims to evaluate the sensitivity of two PCR techniques for the diagnosis of feline and canine sporotrichosis, at the level of genus, in FFPE tissues. Six different species of Sporothrix (S. chilensis, S. mexicana, S. pallida, S. globosa, S. brasiliensis and S. schenckii) from pellets obtained by mycological culture centrifugation and FFPE were used to standardize the extraction and molecular identification methodology Fourteen cat skin samples and 20 dog skin samples treated at the Laboratory of Clinical Research in Dermatozoonosis in Domestic Animals (LAPCLIN-DERMZOO), Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases, from 2009 to 2019, were also used for validation of methodologies, whose diagnosis of sporotrichosis was confirmed by mycological culture. In this study, the FFPE samples were submitted to two protocols of histological sections: (1) 8 sections of 5 µm thick; and (2) one sections of 16 µm thick. DNA extraction from Sporothrix spp. using two commercial kits for FFPE tissues (chemical and thermal extraction) were used and validated in this study. The extracted DNA was used for molecular identification by the nested PCR technique, at the genus level of Sporothrix spp., for the diagnosis of feline and canine sporotrichosis in FFPE tissues based on amplification for the 18S region of ribosomal RNA (ITS). The chemical extraction kit using the protocol of 8 histological sections of 5 µm thick presented better performance. The nested PCR assay, using specific primers for the Sporothrix genus, showed high sensitivity and specificity to identify this fungus in FFPE samples of mycological culture pellets. The DNA extraction and nested PCR methodologies used here have great potential to be applied in the diagnosis of feline and canine sporotrichosis in FFPE samples in clinical routine
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