Otimização de ferramentas moleculares baseadas em multiplex PCR para inclusão de controles de qualidade amostral no diagnóstico das leishmanioses

Abstract

A detecção precoce das leishmanioses e a rápida instituição do tratamento são de suma importância para os indivíduos e comunidades afetadas, visto que pacientes contribuem para a manutenção do ciclo da doença. Diante das limitações apresentadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico, a PCR tem se apresentado como ferramenta promissora para a detecção dos casos. No entanto, perdas de DNA durante o processo de purificação podem afetar mais significativamente o material genético dos parasitos, gerando resultados falso-negativos. Este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar dois protocolos de triplex PCR para investigar possíveis causas de negatividade no diagnóstico molecular das formas visceral (LV) e tegumentar (LT) das leishmanioses. Pares de primers para detecção de um controle interno (gene G3PD) e dois controles externos (DNA genômico de M. pachydermatis e plasmídeo comercial pUC18 foram adaptados a protocolos de PCR convencionais validados para a detecção de L. infantum e L.(V.) braziliensis e duas reações triplex foram otimizadas. Dados de sensibilidade (S), especificidade (E) e eficiência (e) dos novos sistemas foram calculados em 186 amostras de sangue coletadas de cães em áreas endêmicas, utilizando como referência protocolos de PCR e PCR em tempo real (qPCR) consagrados na literatura. A concordância entre os novos testes e os testes de referência foi determinada pelo cálculo do índice de Kappa. A tríplex PCR para o diagnóstico da LV mostrou S = 78.68 por cento, E= 85.29 por cento e e= 81.05 por cento com boa concordância (K = 0.60, p < 0.0001) com o conjunto de resultados PCR/qPCR. Para o diagnóstico da LT observou-se S = 97.29 por cento, E = 79.16 por cento, e = 90.16 por cento, com K = 0.78, (p < 0.0001) indicando excelente nível de concordância entre os testes. As novas ferramentas apresentadas podem ser aplicadas para aumentar a acurácia no diagnóstico das leishmanioses, contribuindo para a rápida implementação do tratamento e, reduzindo a longo prazo os índices de mortalidade e morbidade das leishmanioses.