Análise comparativa do secretoma de cepas de Leishmania (Viannia) braziliensis isoladas de pacientes com manifestações cutânea e disseminada da leishmaniose tegumentar americana e efeito da secreção sobre a infecção in vitro de macrófagos

Abstract

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) causada por Leishmania (Viannia) braziliensis é caracterizada por um espectro de formas clínicas que abrange desde lesões cutâneas simples e autorresolutivas, até múltiplas lesões que envolvem a disseminação do parasito, com comprometimento da mucosa orofaríngea. O papel do parasito no desenvolvimento das diferentes formas clínicas da LTA e, especificamente, no processo de disseminação metastática, ainda não está esclarecido, mas acredita-se que características intrínsecas de algumas cepas podem modular o desfecho clínico. Em espécies do gênero Leishmania, a sobrevivência nos hospedeiros vertebrado e invertebrado envolve intrincados mecanismos de transporte e secreção de moléculas. Algumas das proteínas secretadas por esses parasitos estão implicadas na resistência à lise pelo complemento, na resistência a quimioterápicos e na invasão e lise da célula hospedeira. Entretanto, os mecanismos de liberação e a real função da maioria das moléculas secretadas por este parasito ainda são desconhecidos. O presente estudo visou a caracterização, em larga escala, de proteínas secretadas por cepas de L. (V.) braziliensis associadas a duas formas clínicas polares da LTA: uma associada à forma simples autorresolutiva da doença e outra associada à forma disseminada, com a finalidade de identificar moléculas potencialmente envolvidas na disseminação do parasito. A identificação global das proteínas foi feita usando uma abordagem proteômica quantitativa, por espectrometria de massas. Os secretomas de cada cepa foram obtidos, digeridos enzimaticamente e os peptídeos foram derivatizados usando reagentes de marcação isotópica. Os peptídeos marcados de cada cepa foram misturados e analisados por espectrometria de massas. Os resultados incluíram a identificação de um total de 252 proteínas a partir de 1,176 peptídeos identificados. Das 252 proteínas identificadas, 26 foram diferencialmente abundantes, 13 \201Cup-regulated\201D e 13 \201Cdown-regulated\201D na cepa disseminada em comparação com a cepa cutânea (fold change \2265 1,5 e p<0,05). Estes resultados mostram que é viável identificar proteínas diferencialmente secretadas pelos parasitos usando a abordagem metodológica selecionada. A identidade e função das proteínas identificadas forneceram importantes informações sobre (i) os mecanismos de secreção de proteínas nestes organismos, (ii) a relação parasito-hospedeiro nos primeiros momentos da infecção, e (iii) proteínas potencialmente associadas à disseminação do parasito e/ou com as distintas formas clínicas da LTA. Adicionalmente, ensaios de infecção in vitro de macrófagos peritoneais de camundongo pré-estimulados ou não com secreção de L. (V.) braziliensis demonstraram que macrófagos pré-tratados com o secretoma apresentaram um número maior de amastigotas por célula do que os macrófagos não tratados, sugerindo que as proteínas presentes na secreção de promastigotas tornam os macrófagos mais susceptíveis à infecção in vitro, permitindo uma maior proliferação do parasito. Além disso, análise de citocinas pró-inflamatórias secretadas por macrófagos pré-estimulados com secreção e submetidos à infecção com promastigotas de L. (V.) braziliensis, demostraram que as proteínas secretadas por cada cepa são capazes de modular diferencialmente a secreção de citocinas que favorecem um perfil pró-inflamatório na cepa cutânea, mas não na cepa disseminada, evidenciando o papel fundamental que têm as proteínas secretadas pelo parasito na ativação do macrófago frente à infecção com Leishmania.