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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23336
Tipo
DisertaciónDerechos de autor
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2018-06-30
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AVALIAÇÃO ESTRUTURAL DE PROTEÍNAS DO CITOESQUELETO E DE ALGUMAS DE SUAS PROTEÍNAS ASSOCIADAS EM CÉLULAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS E EPITELIAIS RENAIS DURANTE A CISTOGÊNESE DE TOXOPLASMA GONDII
Garcia, Mariana Coimbra | Fecha del documento:
2016
Autor
Director
Miembros de la junta
Afiliación
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumen en portugues
Toxoplasma gondii, agente etiológico da toxoplasmose, é um protozoário intracelular obrigatório capaz de infectar todas as células nucleadas de seus hospedeiros. A formação de cistos de T. gondii ocorre durante a fase crônica da doença. Estes cistos podem se romper para a formação de novos cistos, permitindo a manutenção do parasitismo, preferencialmente nos tecidos muscular esquelético e neural que, como células diferenciadas, seriam os nichos de eleição do parasito para o estabelecimento da cistogênese. Dessa forma, a utilização da célula muscular esquelética, como modelo celular, mimetiza o processo de diferenciação do parasito, como no sistema in vivo. No entanto, diferentes linhagens de célula epitelial renal têm se mostrado com intensa cistogênese espontânea. Este trabalho visa explorar o comportamento do citoesqueleto da célula hospedeira, durante a cistogênese de T. gondii, avaliando a distribuição de proteínas do citoesqueleto e de algumas de suas proteínas associadas, como a miosina e a plectina, em células musculares esqueléticas (CME - linhagem C2C12) e epiteliais renais (linhagem Vero), in vitro. Para a otimização do modelo músculo foram testados protocolos de diferenciação celular, a fim de obter culturas ricas em miotubos/miofibras. Após analisar diferentes densidades celulares, concentração de cálcio e insulina, foi estabelecida para uma área de crescimento com 132 mm2 a densidade de 7,5 x 104 células na presença de 10 mM de CaCl2 e 100UI/ml de insulina humana como o protocolo de escolha. A análise morfológica das proteínas do citoesqueleto nas CME durante a cistogênese demonstrou reestruturação dos microtúbulos circundando o cisto em células mononucleadas, mas não em miotubo/miofibra e um rearranjo discreto da plectina ao redor do cisto
A desmina, proteína formadora do principal filamento intermediário deste tipo celular, apresentou dois padrões de distribuição em células contendo cistos: concentração da proteína nas extremidades e/ou na periferia celular de miotubos e sem alteração na organização estrutural dos filamentos em miofibras. Nenhuma modificação pode ser notada na disposição da miosina e da F-actina em CME. Com relação às proteínas do citoesqueleto da célula epitelial, houve remodelamento dos microtúbulos e reestruturação dos filamentos de citoqueratina, principal filamento intermediário da célula epitelial, no entrono da estrutura cística. Contudo, nenhuma alteração pode ser detectadas na distribuição da F-actina. Estabelecemos neste trabalho um protocolo para produção e purificação de formas infectantes de T. gondii da cepa ME-49, em linhagem celular Vero, validado por análises quantitativas e ultraestruturais. A geração espontânea de cistos em larga escala em células Vero as aponta como uma metodologia alternativa à de animais experimentais. As alterações na organização de algumas proteínas do citoesqueleto, detectadas em ambos os modelos celulares analisados, enquanto outras permaneceram inalteradas, revela a complexidade da interação do parasito e sua célula hospedeira, que garante o sucesso do parasitismo durante a fase crônica da infecção.
Resumen en ingles
Toxoplasma gondii, etiologic agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan capable of infecting all nucleated cells of their hosts. T. gondii cysts formation occurs during the chronic phase of disease. These cysts may rupture to form new cysts allowing the maintenance of parasitism, preferably in skeletal muscle and neural tissues, such as differentiated cells, would be elected niches for the establishment of cystogenesis. Thus, use of skeletal muscle cells like cell model mimics parasite differentiation process, such in vivo system. However, different lineages of kidney epithelial cells have been shown intense spontaneous cystogenesis. This work aims to explore cytoskeleton behavior of the host cell during cystogenesis of T. gondii, evaluating the distribution of cytoskeletal proteins and some of its associated proteins, as myosin and plectin, in skeletal muscle cells (CME - C2C12 lineage) and renal epithelial (Vero lineage), in vitro. To optimize muscle cell differentiation in order to obtain rich crops myotubes/myofibers we tested protocols. After analyzing different cell densities, concentration of calcium and insulin in a growth area of 132 mm2, 7.5 x 104 cells density was established in the presence of 10 mM CaCl2 and 100 IU/ml human insulin as protocol of choice. Morphological analysis of cytoskeletal proteins in CME during cystogenesis shown reorganization of microtubules surrounding cyst in mononuclear cells, but not in myotube/myofibers and a slight rearrangement of plectin around cyst
Desmin, main filament-forming protein of intermediate type in CME, presented two distribution patterns in cells containing cysts: protein concentration at the ends and/or cell periphery in myotubes and without altering structural organization of filaments in myofibers. No modifications can be noted in myosin and F-actin arrangement of CME. Regarding epithelial cell cytoskeleton proteins, we noted remodeling of microtubules and restructuring of cytokeratin filament, main intermediate filament-forming protein of epithelial cells, around cystic structure. However, no changes could be detected in distribution of F-actin. We established in this work a protocol for production and purification of infective forms of T. gondii of the ME-49 strain in Vero cell line, validated by quantitative and ultrastructural analysis. Spontaneous large-scale generation of cysts in Vero cells show an alternative method to use of experimental animals. Changes in the organization of some cytoskeletal proteins detected in both cell models analyzed, while others remained unchanged, reveals a complex interaction of parasite and its host cell, which ensures success of parasitism during chronic phase of infection.
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