Avaliação estrutural de proteínas do citoesqueleto e de algumas de suas proteínas associadas em células musculares esqueléticas e epiteliais renais durante a cistogênese de Toxoplasma gondii

Abstract

Toxoplasma gondii, agente etiológico da toxoplasmose, é um protozoário intracelular obrigatório capaz de infectar todas as células nucleadas de seus hospedeiros. A formação de cistos de T. gondii ocorre durante a fase crônica da doença. Estes cistos podem se romper para a formação de novos cistos, permitindo a manutenção do parasitismo, preferencialmente nos tecidos muscular esquelético e neural que, como células diferenciadas, seriam os nichos de eleição do parasito para o estabelecimento da cistogênese. Dessa forma, a utilização da célula muscular esquelética, como modelo celular, mimetiza o processo de diferenciação do parasito, como no sistema in vivo. No entanto, diferentes linhagens de célula epitelial renal têm se mostrado com intensa cistogênese espontânea. Este trabalho visa explorar o comportamento do citoesqueleto da célula hospedeira, durante a cistogênese de T. gondii, avaliando a distribuição de proteínas do citoesqueleto e de algumas de suas proteínas associadas, como a miosina e a plectina, em células musculares esqueléticas (CME - linhagem C2C12) e epiteliais renais (linhagem Vero), in vitro. Para a otimização do modelo músculo foram testados protocolos de diferenciação celular, a fim de obter culturas ricas em miotubos/miofibras. Após analisar diferentes densidades celulares, concentração de cálcio e insulina, foi estabelecida para uma área de crescimento com 132 mm2 a densidade de 7,5 x 104 células na presença de 10 mM de CaCl2 e 100UI/ml de insulina humana como o protocolo de escolha. A análise morfológica das proteínas do citoesqueleto nas CME durante a cistogênese demonstrou reestruturação dos microtúbulos circundando o cisto em células mononucleadas, mas não em miotubo/miofibra e um rearranjo discreto da plectina ao redor do cisto A desmina, proteína formadora do principal filamento intermediário deste tipo celular, apresentou dois padrões de distribuição em células contendo cistos: concentração da proteína nas extremidades e/ou na periferia celular de miotubos e sem alteração na organização estrutural dos filamentos em miofibras. Nenhuma modificação pode ser notada na disposição da miosina e da F-actina em CME. Com relação às proteínas do citoesqueleto da célula epitelial, houve remodelamento dos microtúbulos e reestruturação dos filamentos de citoqueratina, principal filamento intermediário da célula epitelial, no entrono da estrutura cística. Contudo, nenhuma alteração pode ser detectadas na distribuição da F-actina. Estabelecemos neste trabalho um protocolo para produção e purificação de formas infectantes de T. gondii da cepa ME-49, em linhagem celular Vero, validado por análises quantitativas e ultraestruturais. A geração espontânea de cistos em larga escala em células Vero as aponta como uma metodologia alternativa à de animais experimentais. As alterações na organização de algumas proteínas do citoesqueleto, detectadas em ambos os modelos celulares analisados, enquanto outras permaneceram inalteradas, revela a complexidade da interação do parasito e sua célula hospedeira, que garante o sucesso do parasitismo durante a fase crônica da infecção.