Eficácia do sistema CRISPR/Cas na edição genômica do gene da síndrome de Wiskott-Aldrich

Abstract

A síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) é causada por mutações no gene WAS, que comprometem a função ou a síntese da proteína WAS (WASP). Correção gênica, in vitro, em células tronco e progenitoras hematopoéticas (CTPH) de pacientes, utilizando estratégias de vetores virais, tem sido realizada para tratamento da WAS, no entanto, a ocorrência de efeitos adversos decorrentes de inserções aleatórias, têm sido associados ao vetor. Nesse contexto, o presente projeto propõe o desenvolvimento de uma estratégia inovadora de terapia gênica, baseada no sistema CRISPR/Cas, para inserção e correção genética sítio-dirigida do gene WAS. O sistema CRISPR/Cas é composto por um RNA guia (RNAg) que interage com endonucleases da família Cas formando um complexo que é direcionado para o DNA alvo por meio de pareamento de bases e induzindo, dessa forma, a clivagem da sequência alvo. Dessa forma, duas sequências guias de 20 nucleotídeos, cada, que compõem o RNAg foram desenhadas, utilizando ferramentas computacionais. A avaliação da eficácia do RNAg em guiar a endonuclease para a clivagem da fita dupla de DNA genômico foi realizada através de caracterização do sítio alvo avaliando a presença de mutações indel no DNA genômico. Após a confirmação da eficácia do RNAg para consequente estímulo da edição gênica do gene WAS, via recombinação homóloga, através da inserção de um DNA doador pelo método de eletroporação (não-viral), foi realizado a quantificação, por citometria de fluxo, de proteína verde fluorescente (GFP) fusionada à sequência de correção do gene WAS, flaqueadas a braços de homologia 3\2019 e 5\2019, contendo aproximadamente 800 pb cada. Nossos resultados mostraram uma alta eficácia de um dos RNAg em localizar o potencial ponto de clivagem da fita dupla de DNA genômico, onde 93,3% das colônias editadas apresentaram mutação indel com pontos de clivagem compatíveis com a literatura. No entanto, a clivagem da fita dupla de DNA genômico realizada pelo RNAg não foi capaz de induzir uma inserção eficiente da sequência de DNA doador. Portanto, sugerimos avaliações adicionais para a otimização do desenho da sequência doadora e/ou uso de moléculas estimuladoras para aumentar a ocorrência de recombinação homóloga para inserção de DNA doador. Dessa forma, será possível provar o conceito da nova estratégia, sítio-dirigida, com finalidade terapêutica.