| Orientador | Bonaldo, Myrna Cristina | |
| Autor | Furtado, Nathalia Dias | |
| Data de acesso | 2018-07-10T18:23:57Z | |
| Data de disponibilização | 2018-07-10T18:23:57Z | |
| Data do publicação | 2018 | |
| Citação | FURTADO, Nathalia Dias. Estudo de mutações nas proteínas virais E, NS3 e NS4B no genoma do vírus vacinal da Febre Amarela 17D. 2018. 119 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018. | pt_BR |
| URI | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27431 | |
| Resumo | A Febre Amarela (FA) é uma doença infecciosa não contagiosa, causada por um arbovírus e objeto de preocupação sanitária mundial. A principal medida de controle é a vacinação com o vírus atenuado da FA, cepa 17D, que é capaz de induzir resposta imune protetora a longo prazo com administração em dose única. Vírus atenuados são potentes vetores de expressão, pois disseminam o antígeno no hospedeiro e induzem resposta imune protetora, contribuindo para o desenvolvimento de vacinas recombinantes. Diversas estratégias foram desenvolvidas para expressão de genes heterólogos pelo vírus vacinal FA 17D. Entretanto, a inserção induz proliferação viral e imunogenicidade reduzidas. Neste trabalho foi utilizado o vírus vacinal FA 17D recombinante expressando a proteína repórter enhanced green fluorescent protein (EGFP) para avaliar o impacto de mutações específicas que possam modular a replicação viral. Mutações nas proteínas E, NS3 e NS4B foram descritas por aumentarem a proliferação viral em cultura de células e em camundongos, no genoma do vírus da dengue, sorotipos 1 e 2. As mutações em E400 (F\2192L), E403 (T\2192I), NS3439 (V\2192S) e NS4B54 (L\2192F) foram inseridas no genoma do vírus FA/EGFP, com a finalidade de caracterizar o seu efeito na proliferação viral e na indução de resposta imune humoral. O cDNA do genoma viral FA/EGFP foi utilizado para gerar vírus recombinantes carreando uma, duas ou três mutações. O estudo de proliferação viral foi realizado por cinética de infecção de células das linhagens Vero, Huh7 e C6/36. Os resultados mostram que os vírus da FA recombinantes se proliferam menos que o vírus vacinal FA 17DD. Além disso, a infectividade dos vírus mutantes em células de mamífero é diferente da infectividade em células de mosquito Os vírus que carreiam as mutações em E400/NS3439 e E400/NS3439/NS4B54 tem a proliferação viral significativamente prejudicada em células de mamífero. Os vírus que carreiam a mutação em E400 apresentaram aumento de proliferação viral em comparação com o vírus FA/EGFP original, em células de mosquito. As diferenças entre os tipos celulares podem ter sido causadas pelas características fisiológicas das células durante a infecção viral e pelas diferenças de propriedades das proteínas virais ocasionadas pela inserção das mutações. Não foi possível recuperar partículas virais infecciosas carreando a mutação em E403. A modelagem molecular das proteínas virais mostrou diferenças discretas de carga, volume de superfície proteica e propriedade físico-química induzidas pelas mutações. Nenhuma das mutações influenciou nas interações intramoleculares. A imunogenicidade foi avaliada por imunização de camundongos das linhagens C57BL/6 e BALB/c com os vírus carreando mutações únicas e os soros foram analisados por PRNT e ELISA para obter os títulos de anticorpos neutralizantes para FA e anticorpos para GFP, respectivamente. Os soros dos camundongos imunizados com os vírus recombinantes apresentam menores títulos de anticorpos neutralizantes em comparação ao grupo imunizado com o vírus vacinal, porém não houveram alterações na indução de anticorpos para GFP. De maneira geral, as mutações em E400 e E403 produziram maiores efeitos sobre a proliferação viral e as mutações NS3439 e NS4B54, na imunogenicidade. | pt_BR |
| Idioma | por | pt_BR |
| Direito Autoral | open access | pt_BR |
| Palavras-chave | Vírus da Febre Amarela | pt_BR |
| Palavras-chave | Proteínas Virais | pt_BR |
| Título | Estudo de mutações nas proteínas virais E, NS3 e NS4B no genoma do vírus vacinal da Febre Amarela 17D | pt_BR |
| Tipo do documento | Dissertation | |
| Data da defesa | 2018 | pt_BR |
| Departamento | Instituto Oswaldo Cruz | pt_BR |
| Instituição de defesa | Fundação Oswaldo Cruz | pt_BR |
| Local de defesa | Rio de Janeiro | pt_BR |
| Programa | Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular | pt_BR |
| Resumo em Inglês | Yellow Fever (YF) is a non-contagious infectious disease, caused by an arbovirus, and the subject of public health concern worldwide. The main measure of control is the vaccination with the attenuated YF virus, strain 17D, which is capable of inducing protective long-term immunity in a single dose. Attenuated viruses are potent expression vectors, for they proliferate in living organisms, disseminating antigen in several tissues and inducing protective immune response. Therefore, these viruses consist in an interesting approach for the development of recombinant vaccines. Several strategies have been employed for the expression of heterologous genes by the YF 17D vaccine virus. However, viruses bearing an insertion display reduced viral proliferation and immunogenicity. In this work the recombinant YF 17D virus expressing an enhanced green fluorescent reporter protein (EGFP) was used to evaluate the impact of specific mutations that can modulate viral replication. Mutations in the E, NS3 and NS4B proteins of dengue virus serotypes 1 and 2 were described as capable of increasing viral proliferation in cell culture and in mice. The mutations E400 (F \2192 L), E403 (T \2192 I), NS3439 (V \2192 S) and NS4B54 (L \2192 F) were inserted into the recombinant YF/EGFP virus genome, with the purpose of characterizing its effect on viral proliferation and the induction of humoral immune response. The cDNA of the viral genome YF/EGFP was used to generate recombinant viruses carrying one, two or three mutations. The study of viral proliferation was carried out by kinetics of infection in Vero, Huh7 and C6/36 cell lines The results show that recombinant YF viruses proliferate less than the vaccine virus 17DD. In addition, the infectivity of mutant viruses in mammalian cells is different from infectivity in mosquito cells. Viruses that carry mutations in E400/NS3439 and E400/NS3439/NS4B54 have significantly impaired viral proliferation in mammalian cells. Viruses that carry a mutation in E400 showed increased viral proliferation compared to the original YF/EGFP virus in mosquito cells. Differences between cell lines may have been caused by the physiological characteristics of the cells during viral infection and by properties of the viral proteins caused by the mutations. It was not possible to recover infectious viral particles carrying the mutation in E403. Molecular modeling of viral proteins showed discrete changes in charge, volume of protein surface and physicochemical property induced by mutations. No mutation influenced on intramolecular interactions. Immunogenicity was assessed by immunization of C57BL/6 and BALB/c mice with the viruses carrying single mutations and sera were analyzed by PRNT and ELISA to obtain the titers of YF neutralizing antibody and titer of antibodies directed to GFP, respectively. Sera from the mice immunized with the recombinant viruses have lower titers of neutralizing antibodies compared to the group immunized with the vaccine virus, but there were no changes in the induction of antibodies to GFP. In general, the mutations in E400 and E403 produced the strongest effects on viral proliferation, and the mutations in NS3439 and NS4B54, on the immunogenicity. | pt_BR |
| Afiliação | Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. | pt_BR |
| DeCS | Mutagênese Sítio-dirigida | pt_BR |
