Desenvolvimento de protocolo de PCR em tempo real para monitoramento da carga viral de cmv em pacientes pós-transplante renal

Abstract

Introdução: O citomegalovírus (CMV) é um vírus que circula de forma assintomática na população, com prevalência de até 90%. Após a infecção primária, permanece no organismo sob a forma latente, podendo ser reativado em situações de imunossupressão, como em pacientes transplantados renais. Nesses, a reativação é importante causa de mortalidade e morbidade, podendo levar à perda do órgão transplantado. Há uma correlação entre carga viral e prognóstico nesses indivíduos, sendo necessário o uso de técnicas que possibilitem o seu monitoramento, aprimorando a sensibilidade e rapidez do diagnóstico. A técnica de PCR em Tempo Real (qPCR) apresenta benefícios em relação às técnicas diagnósticas usualmente aplicadas. Justificativa: O monitoramento da infecção pelo CMV nesses pacientes afeta diretamente a intervenção a ser realizada, pois uma diminuição no uso de imunossupressores administrados pode levar a uma rejeição do enxerto, enquanto que o aumento poderá agravar o quadro infeccioso. Além disso, através da carga viral é possível: a identificação do risco de desenvolvemento de infecção ativa, avaliação da resposta terapêutica e reconhecimento de resistência à drogas. A qPCR é uma técnica que atende à essa necessidade, pois além de monitorar a carga viral, possui uma alta sensibilidade, detectando o vírus em estágios iniciais. Objetivos: O objetivo desse trabalho foi desenvolver um protocolo de baixo custo de padronização da técnica de qPCR baseada na metodologia SYBR Green, para diagnóstico da infecção pelo CMV em pacientes transplantados renais Métodos: Inicialmente foi desenvolvida e otimizada uma Nested PCR, avaliando-se a melhor temperatura de anelamento, para a amplificação do fragmento de CMV utilizando-se primers específicos para a região dos genes iniciais imediatos do vírus. Em seguida, foi realizada a clonagem do fragmento viral, utilizando bactérias competentes e a seleção das bactérias transformadas foi feita através da técnica de \201Cblue/whitescreening\201D. O clone foi utilizado para a obtenção e padronização da curva de qPCR, e em seguida aplicamos o protocolo em 9 amostras de plasma de pacientes, confrontado os resultados com os obtidos usando um kit comercial. Resultados: Através da otimização da Nested PCR, observou-se que a melhor temperatura de anelamento para os primers internos é de 57\02DAC. A amplificação de amostras de DNA isoladas do plasma de pacientes sabidamente positivos apresentaram resultado positivo, gerando fragmento de \2245 150 pb. A PCR após a transformação das bactérias gerou um fragmento de \2245 150 pb, conforme o esperado, mostrando sucesso da clonagem. O sequenciamento do clone revelou que 100% (query cover) da sequência apresentou 99% de similaridade com Herpes Virus-5 Humano (HHV-5). A reação de qPCR apresentou eficiência de 115,95% e R2=0,996, valores que demonstram que o teste oferece alta sensibilidade e permite a detecção de amostras até diluição de 10-5ng/mL. A análise da curva de Melting mostrou que os primers escolhidos são específicos para CMV. Além disso, os resultados foram concordantes com os obtidos pelo kit comercial. Conclusão: O protocolo desenvolvido é um método específico, sensível e de baixo custo. O mesmo se mostrou promissor no contexto do monitoramento dos pacientes no período pós-transplante renal, porém ainda necessita de maior validação.