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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34477
Tipo de documento
DissertaçãoDireito Autoral
Acesso aberto
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável
03 Saúde e Bem-EstarColeções
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TESTE DE ATIVAÇÃO DE MONÓCITOS PARA DETECÇÃO DE PIROGÊNIOS IN VITRO APLICADO À VACINA MENINGOCÓCICA C CONJUGADA
Vacina Meningocócica C Conjugada (MenCC)
Pirogênios
Meningococcal C Conjugated Vaccine (MenCC)
Pyrogens
Silva, Vítor Fernandes | Data do documento:
2017
Autor(es)
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
A detecção de pirogênios em produtos parenterais é mandatória pelas agências
reguladoras. Atualmente, para avaliar o conteúdo de pirogênios, as principais farmacopeias
preconizam o teste de pirogênio em coelhos (RPT), o lisado de amebócito de Limulus (LAL) e
o teste de ativação de monócitos (MAT). Este estudo teve como objetivo avaliar a aplicabilidade
do MAT ao CQ da vacina Meningocócica C conjugada (MenCC) como alternativa ao uso de
coelhos no teste de pirogenia in vivo, ampliar a detecção de potenciais fontes de pirogênios nãoendotoxina (NEPs), realizar análise comparativa entre os diferentes sistemas do MAT,
comparando sistemas validados (ICCVAM 2008) com uma proposta original, sangue
criopreservado/IL-6 e confrontar os dados dos três ensaios de detecção de pirogênios, RPT,
LAL e MAT, aplicados a lotes da MenCC. Os sistemas do MAT combinaram a utilização de
matrizes monocíticas (sangue total fresco e criopreservado) e a detecção de citocinas próinflamatórias (IL-6 e IL-1β) como parâmetros de leitura. Lipopolissacarídeo (LPS), ácido
lipoteicóico (LTA) e zymozan A (ZA) foram utilizados como padrões moleculares associados
à pirogenia de Gram-negativas, Gram-positivas e fungos, respectivamente. Foram avaliados 3
lotes de MenCC produzidos por Bio-Manguinhos. Estes foram incubados em contato com a
matriz monocítica em estufa de CO2 a 37° C e após 16 horas foram quantificadas IL-1β e IL-6
pelo ensaio de ELISA (R&D Systems). Em paralelo, os lotes foram analisados frente aos
métodos farmacopeicos clássicos de detecção de pirogênios, o LAL e o RPT. A validação
produto específica, MenCC frente ao MAT não apresentou interferência, mostrando
aplicabilidade do teste ao produto. Todas as diluições da vacina, bem como a presença do
adjuvante não interferiram na detecção de IL-6 e IL-1β, induzidos pelo padrão exógeno de LPS.
O sistema foi capaz de identificar NEPs (LTA e ZA) na presença de MenCC. Análises
estatísticas demonstraram uma boa correlação entre os sistemas de leituras (IL-1β e IL-6) para
curvas de LPS em NaCl (r=0,9918 e p=0,0001) e em MenCC (r=0,9702 e p=0,0028). Os ensaios
de linhas paralelas das curvas de LPS e LTA em NaCl versus MenCC demonstraram que o pvalor para o não-paralelismo não foi significante para IL-1β e IL-6 (p > 0,05). Os ensaios
quantitativos demonstraram que os 3 lotes foram considerados não pirogênicos, reforçando os
resultados obtidos pelos métodos clássicos RPT e LAL. O presente estudo demonstrou a
aplicabilidade do MAT para a MenCC, observando uma correlação positiva com os ensaios
clássicos RPT e LAL, bem como a análise diferencial e quantitativa de NEPs, potenciais alvos
de contaminação na indústria. Os resultados abrem uma avenida de oportunidades atendendo
o recrutamento internacional de esforços para redução de animais, principalmente para fins
industriais, dando início a uma missão preventiva às futuras regulamentações referentes ao uso
de animais no Brasil.
Resumo em Inglês
The detection of pyrogens in parenteral products is mandatory by regulatory agencies.
Currently, to evaluate the pyrogen content, the main pharmacopoeias recommend pyrogen test
in rabbits (RPT), Limulus amebocyte lysate (LAL) and monocyte activation test (MAT). The
objective of this study was to evaluate the applicability of MAT to CQ of Meningococcal C
conjugate vaccine (MenCC) as an alternative to the use of rabbits in the in vivo pyrogen test, to
increase the detection of potential non-endotoxin pyrogenic sources (NEPs), to perform a
comparative analysis between different MAT systems, comparing validated systems (ICCVAM
2008) with an original proposal, cryopreserved blood / IL-6 and confront data from the three
pyrogen detection tests, RPT, LAL and MAT, applied to batches of MenCC. The MAT systems
combined the use of monocytic matrices (fresh and cryopreserved whole blood) and the
detection of proinflammatory cytokines (IL-6 and IL-1β) as reading parameters.
Lipopolysaccharide (LPS), lipoteichoic acid (LTA) and zymozan A (ZA) were used as
molecular standards associated with Gram-negative, Gram-positive and fungal pyrogens,
respectively. Three batches of MenCC produced by Bio-Manguinhos were evaluated. These
were incubated in contact with the monocytic matrix at 37 ° C with CO2 and after 16 hours IL1β and IL-6 were quantified by the ELISA assay (R & D Systems). In parallel, the lots were
analyzed against the classical pharmacological methods of detection of pyrogens, the LAL and
the RPT. The specific product validation, MenCC vs MAT did not present interference,
showing applicability of the test to the product. All dilutions of the vaccine, as well as the
presence of the adjuvant did not interfere in the detection of IL-6 and IL-1β, induced by the
exogenous pattern of LPS. The system was able to identify NEPs (LTA and ZA) in the presence
of MenCC. Statistical analyzes showed a good correlation between the reading systems (IL-1β
and IL-6) for LPS curves in NaCl (r = 0.9918 and p = 0.0001) and in MenCC (r = 0.9702 and
p = 0.0028). The parallel line assays of the LPS and LTA curves in NaCl versus MenCC
demonstrated that the p-value for non-parallelism was not significant for IL-1β and IL-6 (p>
0.05). The quantitative tests showed that the 3 lots were considered non-pyrogenic, reinforcing
the results obtained by the classical RPT and LAL methods. The present study demonstrated
the susceptibility of MenCC to MAT analysis, observing a positive correlation with the classic
RPT and LAL assays, as well as the differential and quantitative analysis of NEPs, potential
contamination targets in the industry. The results open a range of opportunities, taking into
account the international recruitment of efforts to reduce the animal use, mainly for industrial
purposes, starting a preventive mission to future regulations regarding the use of animals in
Brazil.
Palavras-chave
Teste de ativação de monócitos (MAT)Vacina Meningocócica C Conjugada (MenCC)
Pirogênios
Palavras-chave em inglês
Monocyte Activation Test (MAT)Meningococcal C Conjugated Vaccine (MenCC)
Pyrogens
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