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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34525
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES DA RESPOSTA IMUNE CELULAR E HUMORAL NA TUBERCULOSE PLEURAL
Tuberculose Pleural
Citocinas
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Imunoglobulina A
Imunoglobulina G
Silva, Renan Jeremias da | Data do documento:
2019
Autor(es)
Orientador
Membros da banca
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Resumo
A TB pleural (TBpl) é a principal causa de derrame pleural em nosso meio. Os métodos microbiológicos tradicionais, a histopatologia, teste diagnóstico padrão, e a dosagem da adenosina deaminase (ADA) apresentam limitações. Assim, há uma forte demanda por métodos mais simples, rápidos e acurados, bem como a busca por novos marcadores de TB, que auxiliem o diagnóstico da doença. Assim, avaliamos a resposta imune celular e humoral a novos antígenos (Ag) específicos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em pacientes com TBpl, investigando possíveis biomarcadores da doença que possam auxiliar no diagnóstico. Detectamos, por ensaio imunoenzimático (ELISA) in house, anticorpos IgA e IgG aos antígenos de Mtb, MT10.3, MPT64, PPE59, fusão MPT64:MT10 e a quimera proteica F2, paralelamente, em soros e FP, e a produção citocinas Th1/Th2/Th17 por ensaio CBA, no sobrenadande de cultura de células do FP (PFMC) e sangue periférico (PBMC), estimulados com os antígenos ESAT-6/CFP-10 e PstS1(285-374)/CFP-10, em pacientes adultos com TBpl e com outras pleurisias não tuberculosas (OPL). Oferecemos prova de conceito da aplicabilidade do MT10.3:MPT64 na detecção de Ac por técnica rápida de imunodot. ELISA e dot-ELISA IgA e IgG foram avaliados em amostras pareadas de pacientes com TBpl (n=29) e com OPL (n=39). No ELISA, a imunodominância de IgA-MT10.3:MPT64 no FP foi confirmada em TBpl (86,2%), seguida por PPE59 (62%) e da F2 (51,7%). A IgG-MT10.3:MPT64 no FP e soro exibiu a sensibilidade de 65,5% e 51,7%, respectivamente. Ambos com especificidade de 95% Os resultados dos testes combinados apresentaram sensibilidade para IgA-MT10.3:MPT64/-PPE59 no FP (93,1%) e IgA/IgG-MT10.3:MPT64 (92,3%), seguido por IgA-MT10.3: MPT64/-MPT64 ou /-F2 (89,6%) com especificidade (94,9%). Os resultados combinados da ADA e IgA-MT10.3:MPT64/-F2 no FP demonstraram maior sensibilidade (96,6%), e especificidade de 92,3%. O teste rápido, simples e de baixo custo, baseado no dot-ELISA-MT10:MPT64 para detecção de IgA em FP e IgG em soro foi capaz de caracterizar a imunoreatividade dos antígenos em pacientes TBPL, podendo ser adaptado para um teste tipo \201Cpoint-of-care\201D (POC). Na resposta imune celular, PstS1(285-374):CFP10 apresentou performance comparável ao ESAT-6:CFP-10, porém com aumento significativo na produção de IFN-y por PFMC em TBpl comparado aos OPL, bem como, em relação às PBMC. Produção de IL-10 por PFMC foi significativamente aumentada na TBpl para o ESAT-6:CFP-10 em relação às PBMC, mas não versus controle. As IL-2, IL-6, TNF e IL-17A apresentaram tendência ao aumento em culturas de PFMC, mas sem diferença significativa. O ELISA aqui desenvolvido para a detecção de IgA e IgG, utilizando diferentes marcadores, mostra o potencial desta ferramenta para auxiliar no diagnóstico da TBpl, bem como, pela primeira vez o desenvolvimento de um teste rápido e simples baseado no dot-ELISA-MT10.3:MPT-64. A proteína de fusão MT10:MPT64 se confirmou altamente promissora na detecção de biomarcador IgA em FP, e IgG sérica, que embora com menor sensibilidade tem potencial além dos testes microbiológicos. Combinando os resultados dos testes com a ADA há aumento no potencial diagnóstico. PstS1(285-374):CFP10 mostrou performance similiar ao ESAT-6:CFP-10, com aumento significativo na produção de IFN-y em PFMC na TBpl, mais estudos são necessários para corroborar este dado.
Resumo em Inglês
Pleural TB (TBpl) is the most cause of pleural effusion in our country. Traditional microbiological methods, the standard diagnostic test and the dosage of adenosine deminerase (ADA) have limitations. Thus, there is a strong demand for a simpler, rapid and more accurate methods, as well as the search for new TB markers, which help diagnose the disease. To evaluate the cellular and humoral immune response to new Mycobaterium tuberculosis (Mtb) specific antigens (Ag) in TBpl patients, investigating possible biomarkers of the disease that may to help in the diagnosis. IgA and IgG antibodies to Ag Mtb, MT10.3, MPT64, PPE59, MT10.3:MPT64 and the protein chimera F2 in parallel, in sera and FP, was measure for immunoenzymatic assay (ELISA). Citokine production in vitro for peripheral fluids mononuclear cells (PFMC) and peripheral blood (PBMC) cells, stimulated with the Ag ESAT-6:CFP-10 and PstS1 (285-374)/CFP-10, in adult patients with TBpl and other non-tuberculous pleurisy (OPL). Provide proof of concept of the applicability of MT10.3: MPT64 in the detection of Ac by rapid immunodot technique. ELISA and dot-ELISA IgA and IgG were evaluated in paired samples of patients with TBpl (n = 29) and OPL (n = 39). In ELISA, immunodominance of PF IgA-MT10.3:MPT64 was confirmed in PLTB (86.2%) followed by PPE59 (62%), while serum IgA-F2 (51.7%). PF and serum IgG-MT10.3:MPT64 exhibited the sensitivity of 65.5% and 51.7% sensitivity, respectively. All results displayed 95% specificity. Combinatory results indicated 93.1% sensitivity for PF IgA-MT10.3:MPT64/-PPE59 and IgA/IgG-MT10.3:MPT64 at 92.3% specificity, followed by IgA-MT10.3:MPT64/-MPT64 or /-F2 (89.6%) without jeopardizing specificity (94.9%). The combinatory results of the PF adenosine deaminase test (ADA) and IgA-MT10.3:MPT64/-F2 demonstrated the highest sensitivity (96.6%), with a specificity of 92.3%. Subsequently, a simple, low-cost, rapid test was demonstrated here based on format of a dot-ELISA-MT10.3:MPT64 for detection of IgA in FP and IgG in serum capable of characterizing antigen immunoreactivity in TBPL patients and could be adapted for a “point-of-care” (POC) test. In the cellular immune response, PstS1(285-374):CFP10 presented performance comparable to ESAT-6:CFP-10, but with a significant increase in the production of IFN-γ by PFMC in TBpl compared to OPL, as well as, compared to PBMC culture. IL-10 production by PFMC significantly increased in TBpl, for ESAT-6:CFP-10 compared to PBMC, however not versus control. The IL-2, IL-6, TNF and IL-17A showed a tendency to increase in PFMC cultures, but without significant difference. The ELISA here developed for the detection of IgA and IgG, using different markers, shows the potential of this tool to aid in the diagnosis of TBpl, as well as for the first time the development of a quick and simple test based on a dot-ELISA MT10.3 MPT-64. The MT10: MPT64 fusion protein seems be highly promising in the detection of IgA biomarker in FP, and serum IgG, although with less sensitivity has potential beyond microbiological testing. Combining test results with the ADA increases the diagnostic potential. PstS1(285-374):CFP10 showed similar performance to ESAT-6: CFP-10, with a significant increase in the production of IFN-γ in PFMC in TBpl. Further studies to corroborate this data is deserved.
DeCS
Mycobacterium tuberculosisTuberculose Pleural
Citocinas
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Imunoglobulina A
Imunoglobulina G
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