Vias de permeabilização da membrana plasmática ativadas pelo ATP extracelular

Abstract

O ATP, encontrado em altas concentrações dentro das células, pode ser liberado para o meio extracelular através de vesículas, proteínas formadoras de canal ou devido ao comprometimento da membrana plasmática. Em tecidos inflamados e no microambiente tumoral sua concentração pode elevar cerca de 100 vezes em comparação a tecidos saudáveis. No meio extracelular, o ATP exerce a função de mensageiro e ativa receptores denominados receptores P2. Estes são subdivididos em P2Y, metabotrópicos associados a proteínas G, e P2X, formadores de canal catiônico não seletivo. A ativação do subtipo P2X7 (P2X7R) pelo ATP produz uma corrente não dessensibilizante, levando a despolarização da membrana plasmática e elevação do Ca++ intracelular. Contudo, quando exposto de maneira prolongada a altas concentrações de ATP (>300 uM) ocorre um progressivo aumento da permeabilidade da membrana plasmática a moléculas de alto peso molecular, como o Yo-Pro-1 e o iodeto de propídio. Existem duas possíveis explicações para esse fenômeno: o canal iônico entraria em um estado dilatado permitindo assim a passagem de moléculas de alto peso molecular ou sua ativação desencadearia sinais intracelulares que ativariam uma segunda proteína formadora de poro na membrana plasmática. Evidências recentes apontam que é possível que o próprio canal se dilate, contudo, o bloqueio gênico ou farmacológico da proteína formadora de poro panexina diminui a permeabilização de moléculas de alto peso molecular em alguns tipos celulares e sob certas condições experimentais. Assim, esse trabalho tem como objetivo investigar a capacidade de dilatação do canal do P2X7R. Para tanto, propomos que resíduos no segundo domínio transmembrana no receptor P2X7R (presumivelmente na luz do canal iônico) estariam acessíveis ao composto metanotiofulfonado MTSEA-Biotina Utilizamos mutagênese sítio dirigida para inserir um resíduo de cisteína na região transmembrana 2 do P2X7R (G345C), uma vez que esse resíduo possui a capacidade de se ligar covalentemente ao MTSEA-biotina e assim bloquear parte da permeabilização. Para esse fim, criamos um método de evidenciar a permeabilidade da membrana plasmática a moléculas de alto peso molecular, como o Yo-Pro-1 e o iodeto de propídio, em um leitor de placas. O método se mostrou reprodutível e possui passos de normalização dos resultados que permitem comparar corantes diferentes e evitar artefatos devidos a variações entre os poços. Além disso, o método usado nesse trabalho evita passos de lavagem do poço, uma possível problemática em certos tipos celulares. Adicionalmente foi criado um sistema de expressão heteróloga do P2X7R para ser aplicado nos ensaios com o mutante G345C e determinadas as melhores condições de expressão tanto pela atividade, quanto pela imunodetecção do P2X7R. Durante o desenvolvimento desse trabalho, foi observado que o tratamento com 5 mM de ATP aumenta a permeabilidade da membrana ao iodeto de propídio nas células HEK293T que não expressam o P2X7R. Quando essa célula é transfectada com o P2X7R a permeabilização aumenta cerca de duas vezes, sugerindo haver duas vias distintas: uma dependente e outra independente do P2X7R. A via independente do P2X7R também promove a abertura de um canal iônico e a permeabilidade da membrana plasmática ao iodeto de propídio pode ser bloqueada parcialmente com probenicida, um antagonista da panexina. A via dependente do P2X7R parece envolver a dilatação do canal, uma vez que nossos experimentos sugeriram a acessibilidade do resíduo G345C ao composto MTSEA-biotina. Contudo, ajustes no protocolo são necessários para se obter uma evidência mais clara quanto a acessibilidade desse resíduo.