Análise da expressão heteróloga da enzima MutT na resistência a drogas e defesa contra o estresse oxidativo em Leishmania braziliensis e Leishmania infantum

Abstract

O estresse oxidativo é o grande responsável por gerar danos ao DNA uma vez que a ação de oxidantes produz lesões que podem ser deletérias para célula. A 8-oxoguanina (8-oxoG) é a lesão mais comumente encontrada no DNA, devido à guanina (seu precursor) ser a base nitrogenada que mais sofre oxidação, por causa do seu baixo potencial redox, que facilita essa ação. Quando a 8-oxoG não é reparada ela pode se ligar a adenina, formando um tipo de transversão G:C para T:A. Quando o DNA é replicado ocorre incorporação dessa base gerando quebras de duplas-fitas de DNA e causando morte celular. Por esse fato, a 8-oxoG é utilizada como biomarcador celular de estresse oxidativo. Nas bactérias a enzima MutT é responsável pelo reparo dessa base oxidada. Essa enzima é capaz de prevenir a incorporação de 8-oxoG no DNA, hidrolisando essa base no pool de nucleotídeos, impedindo que ela seja incorporada no DNA no momento de replicação. No banco de dados TriTrypDB o gene da MutT foi anotado em algumas espécies de Leishmania, mas ainda não existem estudos de caracterização desse gene. Para investigar o papel do gene mutT em Leishmania, nesse estudo fizemos a análise da expressão heteróloga da enzima MutT na resistência a drogas e defesa contra o estresse oxidativo em L. braziliensis e L. infantum. O gene mutT de E. coli foi clonado no vetor pGEM-T easy e sequenciado para comprovar a correta sequência nucleotídica. Após subclonagem no vetor específico para expressão gênica em Leishmania, pIR1-BSD, a construção pIR1-BSD-MutT foi transfectada em L. braziliensis e L. infantum. Os parasitos foram plaqueados em meio semissólido contendo Blasticidina (BSD). A análise de PCR mostrou que as colônias que cresceram na presença de blasticidina foram positivas para o marcador BSD. A análise de RT-PCR com iniciadores específicos para os genes mutT e DNA polimerase (gene constitutivo) mostrou a presença do gene mutT em todos os clones analisados. Dois clones de cada espécie foram utilizados para análise fenotípica. Análises de susceptibilidade destes parasitos ao antimônio trivalente (SbIII) mostraram que a superexpressão do gene mutT em ambas espécies de Leishmania não alterou o fenótipo de resistência a esse composto. Analisamos também a defesa desses parasitos contra o estresse oxidativo gerado pelo H2O2. Os resultados mostraram que L. infantum é mais resistente ao H2O2 do que L. braziliensis. Além disto, observamos que as formas promastigotas de L. braziliensis superexpressoras do gene mutT de E. coli foram mais resistentes ao tratamento com H2O2 quando comparadas com os parasitos não transfectados. Entretanto em L. infantum, a MutT parece não estar envolvida na proteção contra o estresse oxidativo gerado pelo H2O2. Análise do ciclo celular mostrou que L. braziliensis após o tratamento com H2O2 permanece por mais tempo na fase subG1, apresentando portanto demora para retornar o seu ritmo normal de crescimento. Por outro lado, L. infantum apresentou um perfil clássico de ciclo celular e os parasitos após o tratamento com H2O2 retomam o seu crescimento normal. Provavelmente esse resultado é devido à menor incorporação de 8-oxoG pela L. infantum comparado com L. braziliensis gerando assim menor número de quebras de fitas-duplas no DNA. Posteriormente investigamos a influência do estresse oxidativo gerado pelo H2O2 no perfil cromossomal dos parasitos superexpressores de MutT utilizando a metodologia de PFGE. O perfil das bandas cromossomais na presença e ausência de estresse foram similares entre os parasitos parentais e os superexpressores de MutT. Concluindo, nossos resultados indicam que a enzima MutT em L. braziliensis é importante para a defesa contra o estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio.