Mecanismos envolvidos no efeito terapêutico de células mesenquimais de medula óssea em modelo experimental de neuropatia diabética sensorial

Abstract

INTRODUÇÃO: A neuropatia diabética sensorial (NDS) é uma das mais comuns complicações do diabetes que se manifesta por distúrbios sensitivos crônicos como dor neuropática e perda de sensibilidade, os quais contribuem para o desenvolvimento do pé diabético, podendo resultar em ulceração e amputação do membro afetado. Diante deste cenário, em função de suas propriedades regenerativas e analgésicas, células mesenquimais de medula óssea (CMsMO) têm sido consideradas promissoras no tratamento das neuropatias em relação a terapêutica atual disponível. OBJETIVO: Investigar os possíveis mecanismos envolvidos no efeito terapêutico das CMsMO em modelo murinho de NDS. MÉTODOS: Quatro semanas após a indução do modelo por estreptozotocina (STZ), camundongos C57Bl/6 (CEUA L-IGM-025/11) receberam uma administração endovenosa de CMsMO (1x106), salina ou gabapentina (70 mg/kg, v.o., 12h/12h por 6 dias) e os limiares nociceptivos térmico (hargreaves) e mecânico (filamentos de von Frey) foram avaliados por 12 semanas. Na 12ª semana, segmentos do nervo isquiático foram coletados para avaliações histológicas por microscopia óptica e eletrônica de transmissão. Amostras de nervo isquiático, medula espinal, gânglio da raiz dorsal (GRD), baço e fígado foram recolhidas para pesquisa das CMsMO transplantadas por PCR quantitativo em Tempo Real (RT-qPCR), assim como a porção L4-L5 da medula espinal foi coletada para análise da expressão de fatores antioxidantes e quantificação de produtos do estresse oxidativo. O perfil de ativação de micróglia, astrócitos e níveis de expressão de galectina-3 na medula espinal foram avaliados por imunofluorescência. Para investigar a hipótese da ação parácrina, o efeito do meio condicionado obtido do cultivo de CMsMO (MC-CMsMO) ou vesículas extracelulares derivadas de CMsMO (VEs-CMsMO) sobre o limiar nociceptivo foi avaliado e VEs-CMsMO foram caracterizadas quanto a sua morfologia, tamanho, quantidade e conteúdo proteico. RESULTADOS: O tratamento com CMsMO reduziu a alodinia mecâ nica e a hipoalgesia térmica, igualando os limiares nociceptivos de animais neuropáticos àqueles do grupo naive. Por outro lado, o tratamento com gabapentina (70mg/kg) reduziu a alodinia e a hipoalgesia somente durante o protocolo de administraçã o do fármaco. Análises por microscopia mostraram que animais com neuropatia apresentaram atrofia axonal, reduçã o do número de fibras mielínicas, atipia mitocondrial e redução da área e densidade das fibras amielínicas no nervo isquiático e que o transplante com CMsMO preveniu o desenvolvimento de tais alterações histológicas no nervo, bem como o aumento dos níveis de expressã o de fatores antioxidantes, nitrito e MDA na medula de animais com NDS. Animais neuropáticos apresentaram aumento no número de astrócitos e micróglia ativados, assim como expressã o de galectina-3 na medula espinal. Este efeito foi inibido pelo transplante de CMsMO, evidenciando açã o moduladora das CMsMO na neuroinflamaçã o espinal. O rastreio das células transplantadas demonstrou que estas possuem tendência em migrar para órgãos filtrantes e ainda assim produzir efeito, evidenciando uma açã o parácrina. Em linha com esta hipótese, a infusã o do MC-CMsMO em animais diabéticos conseguiu reverter os parâmetros comportamentais da neuropatia sensorial de forma semelhante ao tratamento com CMsMO. Resultados da caracterizaçã o das VEs-CMsMO mostraram vesículas com tamanho entre 100-500nm, porém a análise do seu proteoma revelou-se inconclusiva. Contudo, a administraçã o de VEs-CMsMO foi capaz de produzir efeito antinociceptivo, levando os limiares nociceptivos de animais com neuropatia a níveis similares ao de animais saudáveis. CONCLUSÃO: Este conjunto de resultados mostram que o transplante de CMsMO ou infusão do MC-CMsMO ou VEs-CMsMO foram capazes de reverter os parâmetros comportamentais indicativos de dor neuropática e que, além dos efeitos neuroprotetores de CMsMO no nervo periférico, sua ação parácrina pode ser responsável pela modulação da neuroinflamação espinal, podendo esta ser considerada como um importante mecanismo pelo qual as células mesenquimais induzem efeitos terapêuticos durante a neuropatia diabética sensorial.