Caracterização do Sistema de Secreção do Tipo VI de Klebsiella pneumoniae: a função da proteína VgrG

Abstract

Klebsiella pneumoniae é um patógeno oportunista que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos, podendo, porém, acometer pessoas saudáveis. É responsável por várias infecções agudas nos tratos urinário e respiratório, entre outros. Essa bactéria tem gerado preocupação nos sistemas de saúde pública ao redor do mundo pois cepas apresentando altos níveis de virulência e resistência a antimicrobianos tem sido frequentemente isolada. Recentemente, foi demonstrado que o Sistema de Secreção do Tipo VI (T6SS) é um fator de virulência desta espécie. O T6SS é um complexo macromolecular montado através das membranas bacterianas e que atua como uma seringa que injeta proteínas efetoras no interior de outras células. Esses efetores conferem uma vantagem competitiva ou podem manipular o metabolismo da célula hospedeira para favorecer a infecção. Um dos componentes essenciais do T6SS é a proteína Valine-Glycine Repeat G (VgrG). A VgrG é montada no topo da seringa e pode apresentar uma extensão C-terminal variável, com função efetora. Até o momento, não há estudos sobre a função das proteínas VgrG codificadas no genoma de K. pneumoniae. Com o intuito de levantar hipóteses sobre a função do C-terminal da VgrG4 (VgrG4-CTD) de K. pneumoniae, em um trabalho anterior nosso grupo expressou a proteína recombinante e identificou seus ligantes em macrófagos e células do epitélio pulmonar. No total, 254 proteínas foram identificadas nos extratos de células eucarióticas A categorização dessas proteínas revelou que a maioria dos possíveis ligantes são componentes do citoesqueleto, chaperonas ou participam da via endocítica. Neste trabalho, a interação da VgrG4-CTD com vimentina e citoqueratina foi confirmada por imunomarcação; contudo, a interação com tubulina não foi observada por este método. A interação com actina foi confirmada por experimentos de imunomarcação, espectroscopia de fluorescência e co-purificação. Para estudar o efeito de tais interações no contexto da infecção, transfectamos células eucarióticas com a proteína VgrG4-CTD recombinante. Por microscopia de fluorescência foi observado que a VgrG4-CTD induz remodelamento dos filamentos de actina em macrófagos. Em células do epitélio pulmonar, a VgrG4-CTD aumentou a internalização bacteriana. Numa outra vertente do projeto, hipotetizamos que a VgrG4-CTD pode funcionar como um domínio para ancoragem de outras proteínas, possibilitando a translocação delas pelo T6SS. Para estudar esta hipótese, realizamos experimentos de co-precipitação usando a VgrG4-CTD recombinante como isca e identificamos ligantes da VgrG4-CTD em extratos da própria K. pneumoniae. Identificamos que a VgrG4-CTD interage com fatores de virulência bacterianos como EF-TU, Pgk e DeoC. Esses dados, em conjunto, contribuem para melhor caracterização do papel da VgrG4-CTD e do T6SS para a patogênese de K. pneumoniae.