Caracterização Molecular e Funcional de Proteínas Antiofídicas Isoladas do Soro de Didelphis marsupialis da Colômbia

Abstract

Na Colômbia, serpentes do complexo Bothrops asper/atrox são responsáveis por mais de 90% dos acidentes, sendo a Bothrops rhombeatus a principal espécie venenosa no norte do estado (\201Cdepartamento\201D) do Cauca. Os venenos deste complexo se caracterizam por serem hemorrágicos, mionecróticos e/ou pró-coagulantes. Embora existam antissoros comerciais com atividade neutralizante contra eles, a inibição dos efeitos locais é pouco eficiente. Alguns marsupiais da família Didelphidae possuem resistência natural a diversos venenos botrópicos. Através de coevolução presa-predador, estes animais selecionaram proteínas séricas que neutralizam metaloendopeptidases hemorrágicas e fosfolipases A2 miotóxicas, principais responsáveis pelos danos teciduais locais. Do soro da espécie brasileira Didelphis aurita foram já isoladas proteínas anti-hemorrágica (DM43) e antimiotóxica (DM64) com alta afinidade por estas toxinas. Neste contexto, esta dissertação teve como objetivos principais: 1) isolar e caracterizar bioquímica- e funcionalmente a(s) proteína(s) com propriedade(s) antiofídica(s) do soro do Didelphis marsupialis do departamento do Cauca, Colômbia; 2) caracterizar o veneno da serpente simpátrica Bothrops rhombeatus segundo suas atividades biológicas e seu conteúdo proteico. Este veneno mostrou intensa atividade pró-coagulante sobre plasma humano citratado, com dose coagulante mínima de 0,68 µg/mL, a menor já descrita na literatura para o gênero Bothrops Esta atividade foi totalmente inibida por 1,10-fenantrolina, indicando a participação de metaloendopeptidase(s). A dose coagulante mínima sobre fibrinogênio, dependente de serinoendopeptidase(s), foi 20 vezes maior. A(s) metaloendopeptidase(s) foram as principais responsáveis pela atividade proteolítica do veneno sobre azocaseína. O soro de D. marsupialis inibiu a proteólise e também a atividade pró-coagulante do veneno sobre plasma, mas não mostrou efeito sobre a indução de coagulação de fibrinogênio nas concentrações testadas. A presença de proteínas similares a DM43 e DM64 no soro do marsupial colombiano foi confirmada através de immunoblotting, utilizando anticorpos anti-DM43 ou anti-DM64. As proteínas DM43-like e DM64-like foram purificadas através de cromatografias em coluna de troca iônica, seguida de afinidade utilizando miotoxina II de B. asper imobilizada. A fração DM43-like contém três bandas proteicas principais, todas ácidas (pI < 3,5) e glicosiladas (\F07E 26% da massa total) A identificação por espectrometria de massas indicou homologia com DM43, dado corroborado pelo ensaio de imunorrevelação. Uma única proteína, menos ácida (pI 4,2) e menos glicosilada (14%) do que a fração DM43-like, foi identificada como DM64-like. DM43-like inibiu o efeito pró-coagulante do veneno de B. rhombeatus e formou complexo com a metaloendopeptidase jararagina. A proteína DM64-like formou complexo com miotoxina II, mas não inibiu a atividade fosfolipásica do veneno de B. asper. Ainda que homólogas, estas proteínas têm especificidades distintas quanto às toxinas-alvo. O veneno de B. rhombeatus é composto principalmente por metaloendopeptidases e fosfolipases A2 e, em menor medida, por L-aminoácido oxidases e serinoendopeptidases, entre outras proteínas minoritárias. Esta composição permite explicar as intensas atividades proteolítica e prócoagulante dependentes de metaloendopeptidases observadas neste trabalho. Em conclusão, DM43-like e DM64-like constituem novos arcabouços moleculares antiveneno que poderão contribuir para o desenvolvimento de tratamentos otimizados para o envenenamento por serpentes colombianas. Como perspectivas, pretendemos aprofundar o estudo da relação estrutura-função dos inibidores e de suas toxinas-alvo em venenos do complexo Bothrops asper/atrox da Colômbia.