Isolamento e identificação de amebas de vida livre presentes no microbioma intestinal de primatas não humanos

Abstract

Amebas de vida livre (AVLs) são protozoários cosmopolitas amplamente encontrados em ambientes de água doce, naturais e artificiais, no solo e em poeira. Notoriamente, algumas espécies dos gêneros Acanthamoeba spp., Balamuthia spp., Sappinia spp. e Naegleria spp., são potencialmente patogênicas para o ser humano e para outros animais e são consideradas carreadoras de microrganismos por meio de relações transitórias ou simbióticas. A presença de AVLs no microbioma intestinal tem sido aventada, mas pouco explorada. Assim, este estudo teve como objetivo realizar a caracterização morfológica e molecular de AVLs isoladas do microbioma intestinal de primatas não humanos (PNHs). Para tanto, amostras de fezes de PNHs foram diluídas, filtradas e semeadas em meio ágar-não nutriente. As análises morfológicas foram realizadas por observação direta no microscópico invertido e pelas técnicas de coloração Giemsa, Panótico® e Tricrômico. Para a identificação molecular dos isolados foi empregada a reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido da reação de sequenciamento para o alvo molecular 18S rDNA, mitocondrial SSU-rDNA, COI e ITS. Foram coletadas 96 amostras de PNHs do serviço de Criação de Primatas não Humanos (SCPrim) do Instituto de Ciências e Tecnologia em Biomodelos (ICTB, Fiocruz) e cinco amostras de Callithrix spp. de vida livre, da Estação Biológica FIOCRUZ Mata Atlântica. Das 101 amostras de fezes analisadas, 46 foram positivas para AVLs na cultura. As análises morfológicas revelaram que 17 amostras apresentaram majoritariamente cistos com formatos poligonais e/ou trofozoítos com projeções, do tipo acantopódios, representando uma sinapomorfia do gênero Acanthamoeba. As demais amostras, apresentaram cistos arredondados e/ou trofozoítos com pseudópodos tipo lobópodes, três amostras apresentaram a forma flagelar, sugestiva do gênero Naegleria. As técnicas de coloração, Giemsa e Panótico® foram eficientes para evidenciar as estruturas citoplasmáticas das formas trofozoítos e cistos. Todavia, a coloração por Panótico® destacou-se por ser simples, rápida e evidenciou os acantopódios, não observados por meio da coloração de Giemsa. Das 46 amostras positivas, 28 foram amplificadas pela PCR para o alvo 18S do rDNA específico para o gênero Acanthamoeba spp e 33 amostras foram amplificadas quando utilizamos os NA1 e NA2 (amplifica Vermamoeba spp. e Vanella spp.). O sequenciamento de DNA revelou a presença de Acanthamoeba, genótipo T4 em quatro amostras e, em uma amostra identificamos Vermamoeba vermiformis. Todavia, não obtivemos êxito no sequenciamento das demais amostras em virtude da presença de picos duplos e da obtenção de sequências curtas. Os resultados obtidos mostram-nos notavelmente um velho inimigo apresentando novos desafios. A presença de AVLs no intestino de PNHs precisa ser investigada, com potencial relevância para estudos futuros sobre a homeostase intestinal, imunologia da mucosa e potencial patogênico das AVLs e seus organismos intracelulares, podendo ser considerado um campo emergente de suma importância para a saúde publica.