Padronização e aplicação de uma metodologia para determinação do polimorfismo da enzima ácido -aminolevulínico desidratase na avaliação da exposição ao chumbo

Abstract

O chumbo é um metal tóxico, de ocorrência natural na crosta terrestre e utilizado desde a antigüidade. A exposição ao chumbo afeta, especialmente, o sistema hematológico, alterando a atividade de enzimas da biosíntese do heme. Uma destas, a ácido δ-aminolevulínico desidratase (ALAD), apresenta um polimorfismo, com dois alelos (1 e 2), que, possivelmente, modifica a toxicidade do chumbo no organismo. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para investigação deste polimorfismo, que possa ser utilizada em estudos de exposição ao chumbo. Para tanto, foram padronizados métodos para extração de DNA, amplificação, purificação e digestão enzimática. Após padronizada, a metodologia foi aplicada em uma amostra populacional de 50 indivíduos, dos quais também foram determinados os níveis de alguns indicadores biológicos. A partir dos resultados da padronização, ficou estabelecida a seguinte metodologia para genotipagem da ALAD: extração de DNA a partir de 1 mL de sangue total, utilizando o kit GFX Genomic Blood DNA Purification; amplificação por PCR, com o kit Ready-To-Go PCR Beads e os primers 5’-AGACAGACATTAGCTCAGTA-3’ (senso) e 5’-GGCAAAGACCACGTCCATTC-3’ (antisenso); purificação com o kit GFX PCR DNA/GEL Band Purification; e digestão do produto com Msp I (7,5 unidades para 1, 5 µg). A metodologia se mostrou eficiente, específica e sensível para determinação do genótipo da ALAD da população, onde 98% apresentou genótipo ALAD1-1 e 2%, ALAD1-2. Os indicadores apresentaram níveis médios de 4,2 µg/dL(não expostos) e 70,7 (expostos) para chumbo em sangue; 38,1% (não expostos) e 67,2% (expostos) para recuperação da ALAD; 2,4 µmoles/g Hb (não expostos) e 30,3 µmoles/g Hb (expostos) para zinco protoporfirina eritrocitária; e 0,75 mg/g Cr (não expostos) e 13,66 mg/g Cr (expostos) para ácido δ-aminolevulínico urinário. A metodologia para genotipagem da ALAD padronizada neste trabalho pode ser aplicada para determinação do polimorfismo da enzima em estudos de exposição ao chumbo.