Investigação de mecanismos envolvidos na ação leishmanicida de inibidores da Hsp90

Abstract

INTRODUÇÃO A leishmaniose é uma doença infecciosa causada por parasitos protozoários do gênero Leishmania. Independente da manifestação clínica da doença, o tratamento convencional é baseado principalmente no uso de antimoniais pentavalentes e anfotericina B. Entretanto, tais drogas exibem alta toxicidade, efeitos colaterais graves e administração prolongada. Desse modo, a busca por compostos mais eficazes e menos tóxicos para o tratamento da leishmaniose é emergencial. Neste contexto, os inibidores da Hsp90 têm sido estudados para o tratamento da leishmaniose, entre eles, os inibidores da família da geldanamicina (GA). Estudos demonstraram que o 17-N-alil amino 17-demetoxi geldanamicina (17-AAG) foi capaz de reduzir em 90% o percentual de macrófagos infectados por L. amazonensis, assim como o número de parasitos intracelulares. Esse efeito ocorreu em doses que não foram tóxicas para o macrófago, que é célula hospedeira para Leishmania spp. Apesar das evidências do efeito leishmanicida desses inibidores, pouco se sabe como atuam durante a infecção por Leishmania. Assim, para desenvolvimento de um esquema terapêutico ideal para a leishmaniose, por meio do uso de inibidores da Hsp90, a compreensão dos mecanismos envolvidos na ação leishmanicida desses compostos é fundamental. OBJETIVOS O objetivo do presente trabalho foi investigar possíveis mecanismos de ação de inibidores da Hsp90, incluindo GA, 17-AAG e 17-dimetil-amino-etil amino-17-demetoxi geldanamicina (17-DMAG), sobre a morte de Leishmania. Nessa tese focamos principalmente no composto hidrossolúvel 17-DMAG. Nossa hipótese é que os inibidores de Hsp90 teriam um efeito duplo, direto sobre a Leishmania, assim como sobre a célula hospedeira, modulando a resposta inata, facilitando a morte intracelular de L. amazonensis. Assim, a eficácia em matar o parasito em concentrações não tóxicas para o macrófago poderia estar relacionada a uma maior afinidade dos inibidores da família da GA pela Hsp90 do parasito em comparação a sua afinidade pela Hsp90 da célula hospedeira, resultante de possíveis diferenças estruturais e funcionais entre os ortólogos de Hsp90, Hsp83 de Leishmania e Hsp90 da célula hospedeira. Além disso, hipotetizamos que inibidores da família da GA poderiam contribuir para a morte do parasito por meio de ativação do inflamassomo. MATERIAL E MÉTODOS Para avaliação do efeito direto do inibidor, inicialmente, avaliamos a toxicidade de L. amazonensis e da célula hospedeira aos inibidores GA, 17-AAG e 17-DMAG. Em seguida, utilizando uma abordagem in silico, avaliamos as interações presentes entre GA, 17-AAG e 17-DMAG e Hsp83 de L. amazonensis ou Hsp90 humana, e a partir de análises de docking, foi calculada a intensidade destas interações. Posteriormente, foi avaliado o efeito do inibidor de Hsp90, 17-DMAG, na modulação da resposta imune da célula hospedeira, especificamente na ativação do inflamassoma, a partir da avaliação da produção de IL-1\F062 e da influência de NLRP3 na morte do parasito, por meio da avaliação do percentual de infecção e viabilidade intracelular do parasito em macrófagos NLRP3-/-. RESULTADOS L. amazonensis foi mais sensível aos inibidores GA, 17-AAG e 17-DMAG do que a célula hospedeira, com os inibidores apresentando índices de seletividade de 266, 113 e 123, respectivamente. Os dados das análises in silico mostraram predominância de ligações de hidrogênio mediadas por moléculas de água na interação entre os inibidores e Hsp90 humana, enquanto que, ligações diretas de hidrogênio foram observadas entre os inibidores e Hsp83 de L. amazonensis. Em seguida, foi observado que GA, 17-AAG e 17-DMAG tendem a se ligar com maior intensidade a Hsp83 de L. amazonensis do que Hsp90 humana, o que pode estar relacionado às ligações diretas de hidrogênio presentes entre inibidores e Hsp83 de L. amazonensis. Em relação ao efeito do inibidor na célula hospedeira, os dados mostraram que células infectadas tratadas com 17-DMAG apresentaram níveis elevados de IL-1\F062 quando comparados com células infectadas não tratadas, sugerindo ativação do inflamassoma. Entretanto, em macrófagos com inibição de caspase 1 e em macrófagos de camundongos C57BL6 NLRP3-/- a morte do parasito induzida por 17-DMAG não foi alterada, sugerindo que o inflamossomo NLRP3 não tem influência sobre o efeito leishmanicida desse inibidor da Hsp90. CONCLUSÃO Nesta tese apresentamos evidências que o 17-DMAG tem efeito direto na morte de Leishmania, o que pode ser explicado pela maior tendência de ligação entre o inibidor e Hsp83 do parasito do que Hsp90 humana. Estudos serão futuramente conduzidos para esclarecer se a produção de IL-1\F062\F020em macrófagos tratados com 17-DMAG influencia na morte de L. amazonensis em macrófagos infectados e tratados por 17-DMAG.