Identificação de microrganismos cultiváveis associados ao intestino de Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae) com potencial à paratransgênese para o controle da malária

Abstract

Microrganismos contidos no trato digestório de insetos vem sendo isolados e identificados com o intuito de desenvolver ferramentas biotecnológicas para o controle de doenças transmitidas por insetos. Nesse contexto, mosquitos Anopheles de diferentes partes do globo têm sua microbiota investigada com foco em paratransgênese. No entanto, a informação sobre microrganismos associados aos anofelinos neotropicais é escassa. Tratando-se de Anopheles darlingi, o principal vetor de malária no Brasil, até o presente trabalho, não havia informações sobre microrganismos cultiváveis associados a esse vetor. Os objetivos deste trabalho foram isolar e identificar bactérias e leveduras cultiváveis isoladas das fezes de An. darlingi, o principal vetor da malária no Brasil; estimar riqueza e distribuição de frequência das bactérias e leveduras amostradas, e caracterizar e selecionar bactérias e leveduras isoladas das fezes de An. darlingi com potencial para paratransgênese. Os mosquitos An. darlingi fêmeas foram coletados em duas localidades rurais de Porto Velho, Rondônia, Brasil. Para favorecer o crescimento de bactérias, fezes dos mosquitos foram coletadas em meio LB ágar e cultivadas à 37°C por 24 horas, e para propiciar o crescimento de leveduras, fezes dos mosquitos foram coletadas em meio YPD ágar com cloranfenicol e cultivadas à 30°C por 48 horas. Sessenta colônias bacterianas e 60 colônias leveduriformes foram amostradas. Os isolados foram preservados em freezer -80 °C. Foram realizadas PCR utilizado DNA genômico dos isolados com iniciadores para a região do DNA ribossomal 16S para bactérias e 26S e ITS para leveduras. Todas as 60 bactérias isoladas foram identificadas. Das 60 leveduras isoladas, 27 foram identificadas. Os fragmentos foram sequenciados pelo método Sanger e as sequências com similaridades superiores a 97% frente a sequências disponíveis em bancos de dados foram depositadas no GenBank. Para bactérias, MALDI-TOF, VITEK®2 e BBL Crystal foram utilizados como métodos complementares para identificação dos isolados. As bactérias identificadas pertencem a 8 gêneros: Staphylococcus, Burkholderia, Cedecea, Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Serratia e Acinetobacter. As leveduras identificadas pertencem a 7 gêneros: Candida, Meyerozyma (=Pichia), Metschnikowia, Hanseniaspora, Rhodotorula, Papiliotrema (=Cryptococcus) e Pseudozyma. São candidatas à paratransgênese para o controle da malária em An. darlingi as bactérias do gênero Pantoea e Serratia e as leveduras dos gêneros Meyerozyma (Pichia), Metschkowia, Hanseniaspora e Pseudozyma.