Explorando os mecanismos fisiopatológicos da sepse através da análise proteômica de vesículas extracelulares isoladas do plasma de pacientes

Abstract

A sepse é a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva no Brasil e uma das condições de maior ônus econômico por pacientes hospitalizados. Atualmente a sepse é definida como disfunção orgânica potencialmente fatal, decorrente de uma resposta imune desregulada frente a uma infecção. Sua forma mais grave, o choque séptico, ocorre na presença de profundas anormalidades circulatórias e do metabolismo celular, aumentando o risco de morte. Durante a resposta imune, a sinalização celular é fundamental na coordenação de um desfecho resolutivo. Recentemente, a comunicação intercelular, via secreção e captação de vesículas extracelulares (VEs) pelas células efetoras da resposta imune, passou a ser explorado no contexto da sepse. As VEs são estruturas que contêm biomoléculas, diretamente relacionadas às suas células de origem. Metodologias voltadas para análises globais de biomoléculas, como a proteômica, possibilitam a identificação e interpretação de perfis moleculares associados às condições clínicas, contribuindo na compreensão dos mecanismos fisiopatológicos complexos como a sepse. O presente trabalho, consiste na aplicação da abordagem proteômica shotgun, para análise exploratória de VEs isoladas do plasma de pacientes com sepse e choque séptico, comparados aos de indivíduos saudáveis. Para tal, diferentes métodos de isolamento das VEs foram testados, e demonstramos que a cromatografia de exclusão molecular (SEC do inglês: Size Exclusion Chromatography) é a técnica mais adequada para o isolamento de VEs do plasma, voltado para análise proteômica A quantificação relativa das VEs isoladas por SEC, nas amostras dos grupos experimentais, demonstrou que, apesar da concentração de VEs ser heterogênea, entre amostras do mesmo grupo de análise, as amostras do grupo choque, possuem a média de concentração mais elevada, comparado aos grupos sepse e controle. Porém, o tamanho relativo da maioria das VEs analisadas permaneceu entre 50 e 150 nm, e essa característica foi observada em todos os grupos de análise. Após a análise proteômica das VEs isoladas de amostras de pacientes (sepse + choque séptico) e controles, confirmamos a presença de proteínas comumente identificadas em trabalhos de análise de VEs do plasma como: Anexinas; Tetraspaninas; Enzimas Glicolíticas; Pequenas GTPases, Componentes do citoesqueleto, entre outros. A análise quantitativa (por spectral counting - SC) demonstrou diferenças entre o proteoma das VEs das amostras de pacientes e controles. Proteínas identificadas diferencialmente no grupo de pacientes, estão associadas a um perfil pró-inflamatório e pró-trombótico, especialmente envolvidos na ativação plaquetária, nas interações celulares associadas a modulação da barreira endotelial e na transmigração celular, bem como na degranulação de neutrófilos. As proteínas diferencialmente abundantes, quando comparamos os grupos sepse e choque séptico, estão relacionadas principalmente à via de degranulação de neutrófilos, enriquecida no grupo choque séptico, indicando um possível perfil molecular associado a gravidade. A caracterização do proteoma de VEs de pacientes com sepse e choque séptico, contribuiu com informações que permitem compreender os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na desregulação da resposta imune, sob uma nova perspectiva, onde as VEs, através do seu conteúdo molecular, podem modular a resposta imune e os mecanismos associados ao estabelecimento da sepse