Otimização e atividade biológica de derivados de pirazol sobre Trypanosoma cruzi: análise computacional, ensaios de reversibilidade e modelo de cultivo 3D como potenciais ferramentas preditivas de eficácia

Abstract

A doença de Chagas é uma doença negligenciada que acomete 6-7 milhões de indivíduos no mundo, com a estimativa de 1,2 a 4 milhões de indivíduos infectados no Brasil. Esta doença centenária causa elevada morbidade e mortalidade, alcançando 10.000 mortes ao ano no mundo. Os fármacos utilizados na clínica, benzonidazol (BZ) e nifurtimox, possuem importantes limitações incluindo eficácia parcial na fase aguda (60-80%) e baixa eficiência na fase crônica, efeitos adversos graves, contraindicação para gestantes e portadores de insuficiência renal e hepática e ainda, como constatado para o BZ, incapaz de prevenir a cardiomiopatia chagásica e eliminar amastigotas dormentes na fase crônica da doença. Assim, a descoberta de novos fármacos efetivos e seguros é essencial para o manejo desta doença silenciosa. Neste estudo, cinco séries de derivados de pirazol, pirazol-carboxamida (séries 1(a-l) e 2(a-l)) e pirazol-imidazolina (3(a-n), 4(a-c) e 5(a-c)) foram elaboradas com base no composto hit, que possui cruzipaína como alvo, visando otimizar a atividade contra Trypanosoma cruzi. As análises in sílico de propriedades físico-químicas, utilizando o programa Datawarrior e SwissADME, revelaram um perfil de boa biodisponibilidade oral e ausência de promiscuidade dos derivados de pirazol, sem violação da regra de Lipinski e sem alerta de PAINS. Os derivados de pirazol não apresentaram citotoxicidade, alcançando valores de CC50> 160 μM. Ensaios de triagem fenotípica foram realizados contra formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares de T. cruzi (clone Dm28c-luciferase) a fim de avaliar a atividade tripanocida dos derivados de pirazol in vitro. Os resultados revelaram que, em geral, os derivados de pirazol sintetizados possuem baixa atividade contra tripomastigotas (IC50>34 μM), mas três análogos de pirazol-imidazolina (3g, 3j e 3m) apresentaram atividade contra amastigotas intracelulares similar ao BZ (IC50 = 4,67±0,22), alcançando valores de IC50 entre 2,75 e 6,09 μM e índice de seletividade maior que 40. A análise da relação de estrutura-atividade revelou que a introdução de substituintes, como Cl, Br e metil, na posição meta do anel benzeno acarreta aumento da potência dos compostos, com os derivados 3j (pIC50=5,56) e 3m (pIC50=5,45) apresentando maior potência que o Bz (pIC50=5,33). Além disso, a posição orto do anel benzeno parece ser um domínio subótimo para substituições. Ainda, o efeito reversível da infecção foi avaliado para os análogos 3g, 3j e 3m. Nesta abordagem, os compostos foram removidos após 72h de tratamento das culturas de células VERO infectadas e o perfil de infecção avaliado por luminescência nas 72h subsequentes. Todos os derivados induziram redução significativa na carga parasitária, mas somente o composto 3m teve eficácia similar ao BZ (100 μM), sem recrudescência do parasitismo na concentração de 2 vezes o valor de IC90 (50 μM). A atividade dos derivados 3g, 3j e 3m também foi avaliada no modelo 3D de células VERO, mimetizando a organização tridimensional e fisiologia dos tecidos. Todos os análogos avaliados acarretaram redução significativa na carga parasitária, destacando-se o análogo 3m, que apresentou efeito similar ao BZ, com evidente redução do parasitismo no microtecido. A predição das propriedades ADMET demonstra que os compostos promissores apresentam boa absorção, são inibidores de CYP1A2 e substrato de CYP3A4 e glicoproteína P, não são mutagênicos ou carcinogênicos, mas apresentam hepatotoxicidade e inibição de hERG, sugerindo a possibilidade de alteração na condução elétrica do miocárdio. Por fim, as análises de atividade de enzimática, utilizando substrato fluorogênico, demonstraram que os análogos 3g, 3j e 3m não são potentes inibidores de cisteína protease, com valor máximo de 45% de inibição desta enzima. Em conjunto, os dados reforçam o potencial tripanocida do híbrido pirazol-imidazolina, cujas mudanças estruturais beneficiaram a atividade contra amastigotas intracelulares em modelos 2D e 3D, sugestivo de boa permeabilidade e absorção pelos tecidos e ainda, demonstraram atividade tripanocida sustentável, sem reativação da infecção in vitro. Novas propostas de otimização serão elaboradas a fim de potencializar a atividade tripanocida e avançar para ensaios pré-clínicos in vivo, contribuindo para a identificação de compostos com potencial de prosseguir em ensaios clínicos para terapia da doença de Chagas